[发明专利]一种固定化氨基酰化酶的制备方法及其产品和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化酶的制备方法及其产品和应用，具体的涉及一种 固定化氨基酰化酶的制备方法、由其制得的固定化氨基酰化酶及其应用。

背景技术

氨基酰化酶主要用于拆分酰化-DL-氨基酸为L-型和D-型光学活性氨基 酸。在生产光学活性氨基酸中可以使用自由酶，但是稳定性差，而且自由酶 只能采用批式反应器，反应后酶不能回收，使产品的分离纯化困难，容易造 成蛋白质污染，所以对生产非天然氨基酸来说自由酶还不是一种理想的催化 剂。为了克服自由酶的各种缺点，人们大量研究固定化氨基酰化酶的工艺以 及应用技术，1969年，Chibata等以DEAE-Sephadex为载体将米曲霉氨基酰化 酶固定化，但是该固定化材料昂贵，只能够用于固定化床反应，工业操作并 不方便。

卡拉胶是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物，作为固定化材料具有 稳定性好、成本低的优点，是用量最为广泛的固定化材料。但是它有两个比 较大的缺点：一是它的凝固点太高，众所周知工业生产上固定化操作均在凝 固点附近进行，这不仅给固定化成形带来困难，而且严重影响被包埋细胞及 酶的活性；二是固定化后的胶一般是大的块状，需要手工或者机械切片，而 片状催化剂装卸入反应器不方面，片状流动性差，在反应器内容易流体短路 等，而切片也增加了工序以及造成催化剂的流失。

为了降低卡拉胶的凝固点，国内外进行了大量的卡拉胶复配固定化研 究，如欧阳平凯等用卡拉胶混合凝胶固定化延胡索酸酶生产L-苹果酸，无锡 轻工大学陈坚等PVA-卡拉胶混合载体固定化大肠杆菌-酵母菌混合体系生产 谷胱甘肽等。

球状(颗粒状)催化剂具有广泛的优点，能否把卡拉胶固定化酶由一般 的片状改为球状？如果能够成为球状，就具有了良好的流动性，可以方便用 于流化床与反应釜中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的固定氨基酰化酶的材料 中价格昂贵，只能够用于固定化床反应，工业操作并不方便，以及凝固点太 高不易固定化成形且影响酶活性，固定化后的胶多是大的块状或片状，流动 性差等缺陷，而提供了一种固定化氨基酰化酶的制备方法、由其制得的固定 化氨基酰化酶及其应用。本发明的制备方法可有效降低固定化材料的凝固 点，并且制得的固定化氨基酰化酶是颗粒状，流动性好，可以高效方便的拆 分光学活性氨基酸。

发明人发现，明胶凝固点较低，同时也是固定化材料，在卡拉胶中混合 一定比例的明胶，可以有效降低固定化材料的凝固点；发明人还发现，基于 反相悬浮技术，以有机溶剂为固定化溶剂，将熔融的固定化材料滴入有机溶 剂中，可以制备出颗粒状的固定化酶。

发明人将以上两点结合使用，制备出凝固点低而且是颗粒状的固定化 酶，并将这样的酶成功地应用于流化床与反应釜中，高效方便地拆分生产了 光学活性氨基酸。

本发明涉及一种固定化氨基酰化酶的制备方法，其包含下列步骤：在水 中，60-90℃下将固定化材料(卡拉胶和明胶)溶解，降温至40-60℃，再加 入氨基酰化酶，混合均匀，然后将此混合液流加到温度为20-35℃的有机溶 剂中，搅拌，过滤得颗粒，将所得颗粒加入到KCl水溶液中固化，即可制得 固定化氨基酰化酶，其中，所述的KCl水溶液中还含有戊二醛。

其中，所述的卡拉胶和明胶的重量比较佳的为80-95∶20-5，优选88-92∶ 12-8；所述的固定化材料(即卡拉胶和明胶)与水的重量比较佳的为1-8∶ 99-92；所述的氨基酰化酶与固定化材料的重量比较佳的为1-15∶99-85；所 述的有机溶剂较佳的为煤油、汽油、植物油、石油醚、苯和甲苯中的一种或 多种，更佳的为煤油、汽油和植物油中的一种或多种；所述的固化时间较佳 的为2小时；所述的KCl水溶液中KCl的浓度较佳的为0.1N，其中戊二醛的浓 度较佳的为0.5％(重量百分比)。

本发明中，上述制备方法制得的固定化氨基酰化酶的外观呈现为颗粒 状。

本发明进一步涉及由上述制备方法制得的固定化氨基酰化酶。

本发明还涉及上述固定化氨基酰化酶在催化合成光学活性的氨基酸中 的应用，其包含下列步骤：在固定化氨基酰化酶的催化下，乙酰化氨基酸被 拆分为光学活性的氨基酸。

其中，所述的应用较佳的包含下列步骤：