[发明专利]固定化沙雷氏菌脂肪酶、制备方法及其催化拆分地尔硫卓手性前体的用途

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及固定化沙雷氏菌脂肪酶、粘质沙雷氏菌胞外脂肪酶的固定化，以及固定化脂肪酶在医药前体生产中的应用。

技术背景

地尔硫卓(Diltiazem)是上世纪70年代发现并合成的苯并噻平类钙离子通道阻滞剂，它作用于冠脉血管及末梢血管的血管平滑肌及房室结，对钙通道有阻滞作用，能抑制钙离子向细胞内流入，降低血管平滑肌细胞内游离钙离子的浓度而使血管平滑肌松弛；并能有效地扩张小动脉血管，增加冠脉血流量，降低冠状静脉氧差，有降低心率和血压作用。可用于室上性心律失常，典型心绞痛，变异型心绞痛，老年性高血压等病症的治疗。由于该药疗效确切，毒副作用小，是心血管疾病治疗的重要药物。

对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，简称MPGM，其左旋异构体[(2R，3S)-(-)-MPGM]是心血管药物地尔硫卓合成的重要中间体，目前有不少单位在进行(-)-MPGM的开发制备。粘质沙雷氏菌脂肪酶是催化(±)-MPGM水解拆分，制备光学纯(-)-MPGM的优良生物催化剂[中国专利ZL200410067046.1]。由于游离脂肪酶的稳定性相对较低，难以重复使用，而且酶液中的复杂组分给产品的纯化处理带来较多麻烦，因此有必要对脂肪酶进行固定化。

日本的田边公司[J.Ferment.Bioeng.，1994，78：59-63]使用中空纤维膜对沙雷氏菌脂肪酶进行截留固定化，并使用固定化了脂肪酶的中空纤维膜反应器进行(±)-MPGM的水解拆分。固定化脂肪酶能重复使用5批次，当上载的酶失活时，可以将其洗脱之后上载新酶。尽管如此，由于膜传质阻力的存在，导致反应速率较慢，第一轮反应需要23h才能达到反应终点。在先前研究中，我们发现环氧树脂(如Eupergit C)和硅藻土是比较好的沙雷氏菌脂肪酶固定化载体[催化学报，2007，28：175-179]，固定化脂肪酶可以重复使用5～10批。尽管如此，使用环氧树脂共价偶联法进行酶的固定化，载体价格比较昂贵，固定化酶成本高；而使用硅藻土吸附法进行固定化，虽然固定化方法非常简单，酶上载容量也较大，但是固定化酶的稳定性仍不够高，反应和分离操作也不太方便，这些问题限制了这两种固定化方法的工业化应用。

壳聚糖是一种天然高分子化合物，表面拥有大量羟基和氨基，生物相容性好，将其用于酶的固定化具有许多显著的优点：廉价、无毒、拥有很好的亲水性、高孔隙度以及大的表面积；可操作性强，能通过多种方式与酶结合；制备的固定化酶的空间阻碍低，传质阻力小。另外，壳聚糖是一种可生物降解材料，在其固定化的酶完成催化剂的使用寿命周期后容易进行处理，且对环境友好。

在本发明中，发明人使用壳聚糖作为沙雷氏菌脂肪酶的固定化载体，载体价格低，酶的上载容量以及酶活回收率较高，使用固定化脂肪酶催化(±)-MPGM的水解拆分，反应速率快，对映选择性好，产品光学纯度高，固定化酶可以多次重复使用，应用成本低。

发明内容

本发明目的是提供一种固定化沙雷氏菌脂肪酶。

本发明目的还提供一种上述固定化沙雷氏菌脂肪酶的制备方法。

本发明另外一目的是提供一种上述固定化沙雷氏菌脂肪酶的在医药前体生产中的应用，用固定化脂肪酶催化(±)-MPGM的水解拆分，制备光学纯的(2R，3S)-(-)-MPGM，作为合成心血管药物地尔硫卓的手性中间体。

本发明的采用的沙雷氏菌脂肪酶是由粘质沙雷氏菌经发酵培养产生的胞外脂肪酶。

本发明的固定化沙雷氏菌脂肪酶该固定化酶以天然高分子化合物壳聚糖为载体骨架，酶通过戊二醛的交联作用共价结合固定在壳聚糖载体表面。

本发明的固定化沙雷氏菌脂肪酶的制备方法如下：

1、沙雷氏菌脂肪酶固定化载体的制备

由于壳聚糖干粉结构紧密，相对表面积较小，直接使用壳聚糖粉进行脂肪酶的固定化，酶的上载量低，因此需要对壳聚糖进行适当的预处理，提高酶的上载能力。壳聚糖具有可溶于稀酸溶液(包括甲酸、乙酸等有机酸和盐酸、硫酸等无机酸)，不溶于碱性溶液的性质，因此先将壳聚糖溶解于一定浓度的酸溶液中，所用的酸可以是甲酸、乙酸等有机酸，也可以是盐酸、硫酸等无机酸，壳聚糖溶液的浓度为0.5～5％重量/体积(w/v)，酸的浓度为0.5～5％(w/v)。然后用碱中和壳聚糖溶液中的酸，获得固化成型的壳聚糖载体。这里选择二种方法制备壳聚糖固定化载体，分别为：