[发明专利]一种利用高通量测序单通道复用技术进行microRNA表达谱测定的方法

说明书

技术领域

本专利涉及一种在适用于超高通量新一代测序的单通道复用技术，可以在单通道中同时定量多个样本microRNA表达谱。

背景技术

微小核糖核酸(microRNA或miRNA)是一种长度为～22nt的非编码RNA。在线虫、拟南芥、果糖、人类等动植物细胞中都有发现。在生物体内，microRNAs基因是由RNA聚合酶II(Pol II)或RNA聚合酶III(Pol III)转录而生成含有茎环结构的初级miRNAs(primary-miRNAs，pri-miRNAs).pri-miRNAs随后分别由Drosha和Dicer切割加工成大约22nt的miRNA双链体(duplex).双链体中的功能链进miRNA诱导的沉默复合体(miRNA-induced silencing complex，miRISC)中，通过碱基对相互作用指导复合物识别靶标分子的3’非翻译区(3’untranslated regions，3’-UTRs)，对靶mRNAs进行调控.miRNAs对于靶分子的调节包括两种方式，一种是直接对靶mRNAs进行降解，另一种方式是通过抑制靶mRNAs的翻译来实现调控的。microRNA以转录后调控的方式精细调节着个体发育、细胞凋亡、增殖、分化、代谢，以及病毒感染等生命活动和细胞过程(]L.P.Lim etal.，The microRNAs of Caenorhabditis elegans.Genes Dev.17(2003)，pp.991-1008)。

越来越多的研究证实microRNA也是癌症的遗传标签。它们与癌症的发生和晋级有关。microRNA可以作为癌症的分子标志物和也是潜在的治疗药物靶点(Mallardo M，Poltronieri P，D′Urso OF.Non-protein coding RNA biomarkers and differential expression in cancers：a review.J Exp Clin Cancer Res.2008Jul 16；27：19.)。

常规的microRNA检测方法包括northern杂交、原位杂交、实时定量PCR等。基因芯片是常用的高通量的检测方法。然而随着新一代高通量测序技术的发展，基于测序的高通量microRNA定量技术日益显示出优势来。

目前市场上有四种高通量测序仪，分别是Solexa，454(GS-FLX)，SOLiD和Polonator。根据测序原理，它们可以被分为两大类：使用合成法测序(Sequencing by Synthesis)的Solexa和454，及使用连接法测序(Sequencing by Ligation)的Polonator和SOLiD。在定量microRNA表达谱的应用中，基本步骤是将microRNA样本进行预处理后，利用这些高通量测序仪直接进行并行测序。然后根据测得序列的种类和个数，便可以准确计算每个microRNA的表达量。基于测序的microRNA表达谱定量技术克服了传统的基因芯片技术存在的非特异杂交和噪音背景较高的特点，具有更好的重复性和敏感性。

然而基于新一代测序技术的microRNA表达谱定量技术存在这样的问题：1.价格仍然过高；2.八个通道的并行性对于大规模的生物学实验设计仍显不足；3.由于单通道可以测得超过3000000个microRNA序列，而每个细胞大约只有50000个拷贝，因此测序深度大约为60倍，已经远远超过定量的要求，造成一定程度的浪费。

一次我们设计的方法用条码标记技术对不同的生物样本进行标记，标记后将样本等量混合，然后进行超高通量测序。增加单次实验并行的样本数，并且节省了成本。

利用传统microRNA芯片，在上样量为1ug总RNA的情况下，一个10amol的microRNA基因大约90％的机会被检测出来。这个浓度大约相当于每个细胞100个拷贝(每个细胞的microRNA拷贝总数为50000)(Kim VN.MicroRNA precursors in motion：exportin-5mediates their nuclear export.Trends Cell Biol.2004Apr；14(4)：156-9)。对于基于测序技术的microRNA表达谱定量，我们要获得与microRNA芯片同样的敏感度，我们假设至少要测出n个序列，那么需要满足