[发明专利]甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及用甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶，及其制备与应用。

背景技术

早在30多年前，Storr和Burton就提出控制氨基酸在肿瘤治疗上的可能性(Storr JM， Burton AF.The effects of arginine deficiency on lymphoma cells.Br J Cancer.30：50-59(1974))， 其中，被研究的最多的是天冬酰胺酶，它能分解细胞生长和细胞生命维持所需的天冬酰胺。 在许多白血病(Leukemia)患者中，白血病细胞与正常细胞不同，它们自己不能合成天冬 酰胺，必须依靠外界提供的天冬酰胺来维持生存。天冬酰胺酶的治疗耗尽体内肿瘤细胞所 需的游离天冬酰胺，从而导致肿瘤细胞死亡，而正常细胞不会受到太大影响。但是，L-天 冬酰胺酶是来源于微生物，对人体来说具有很强的免疫原性，进入人体以后很容易诱导生 成抗天冬酰胺酶的抗体，产生副作用并影响其疗效；但是，如同Y.K.Park等在Antieancer Res.1：373-376(1981)中描述的，由于L-天冬酰胺酶受其分子量大小的限制，进入人 体后容易被肾脏过滤清除，从而影响其在体内的循环半衰期。用聚乙二醇共价修饰的大肠 杆菌L-天冬酰胺酶降低了其抗原性，延长了其循环半衰期(Y.Kamisaki等， J.Pharmacol.Exp.Ther.216：410-414(1981))；Y.Kamisaki等，Gann.73：47-474 (1982))。

正常细胞的生长不需要精氨酸，因为它们能通过由精氨琥珀酸合成酶和精氨琥珀酸裂解 酶催化的一个两步反应从胍氨酸合成精氨酸。然而肝细胞瘤、黑色素瘤和其他一些的肉瘤不 表达精氨琥珀酸合成酶，因而它们是精氨酸的营养缺陷型。精氨酸脱亚氨酶能催化精氨酸向 胍氨酸的转化，可被用来清除精氨酸。这方面的研究工作，最早是J.B.Jones在“精氨酸 脱亚胺酶对小鼠白血病成淋巴细胞的作用”，博士论文，The University of Oklahoma，1-165 页(1981)中开始研究的。他从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中提取的精氨酸脱亚胺酶 (ADI)，在体外可以有效杀死肿瘤细胞，特别是肝癌和黑色素瘤相关的肿瘤细胞，但是从恶 臭假单胞菌中提取的ADI在体内却没能表现出其应有的作用，研究发现是因为中性pH下几乎 没有酶活性，并且因为恶臭假单胞菌中提取的精氨酸脱亚胺酶(ADI)对实验动物来说具有很 强的免疫原性，进入机体以后很容易诱导生成抗体，形成抗原-抗体免疫复合物从实验动物 的血液循环中被快速清除，如Takaku et al，Int.J.Cancer，51：244-249(1992)和美国专利 NO.5,474,928中描述的，在此将其公开全部引为参考。Takaku等人用聚乙二醇通过氰尿酰 氯基团对从精氨酸支原体中提取的精氨酸脱亚胺酶进行化学修饰。修饰后的精氨酸脱亚胺酶 虽然在体外的生物学活性显著下降，但是，由于PEG修饰降低了精氨酸脱亚胺酶的免疫原性， 因此在体内保留了抗肿瘤的活性(Takaku等，Jpn.J.Cancer.Res.84：1195-1200(1993))。然而， 限于当时的技术水平，采用的修饰方式为氰尿酰氯连接基团，这种连接方式并不稳定，而且 有可能释放出有毒的代谢产物，因此限制了其在临床上的使用。进一步的，Clark，Mike A在 美国专利NO.6183738中所提到的，通过用琥珀酰亚胺基团作为连接基团来修饰精氨酸脱亚 胺酶，避免了用氰尿酰氯基团修饰存在的缺陷，也同样制备获得了在动物体内具有抗肿瘤的 活性的PEG化精氨酸脱亚胺酶，并在人体中的应用进行了研究(Steven A Curley， Hepato-Gastroenterology，50：1208-1211(2003)；Francesco Izzo，J Clin Oncol. 22：1815-1822(2004)；Paolo A.Ascierto，J Clin Oncol 23：7660-7668(2005))。但是，对 于常规的用聚乙二醇来修饰生物活性的蛋白，包括精氨酸脱亚胺酶，L-天冬酰胺酶等都会导 致酶活性的严重下降，甚至完全丧失。(Reza Mehvar J.Pharm Pharmaceut Sci.3：125-136(2000))。例如：O.Schiavon(Il Farmaco 55：264-269(2000))研究了用不同 的聚乙二醇来修饰Uricase，最终获得的聚乙二醇化Uricase生物学活性仅为原来的0-40％之 间；Yuying Tan(PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION 12，45-52(1998))；Zhijian Yang(CANCER RESEARCH，64：6673-6678(2004)研究制备聚乙二醇化methioninase 用于肿瘤的治疗，用重均分子量为5000的聚乙二醇修饰methioninase后，也仅保留了40％的生 物学活性。而且，对于一个蛋白分子结合多个聚乙二醇后，随着聚乙二醇结合数量的增加， 对活性的影响更加显著。Frederick W.Holtsberg等(Journal of Controlled Release，80：259-271 (2002))在研究聚乙二醇修饰精氨酸脱亚氨酶时发现，当一个精氨酸脱亚氨酶结合8-10个 PEG₂₀₀₀₀分子时，其酶活性仅保留了不到50％。对于用于治疗用途的这些PEG修饰的酶，保 留生物学活性和增加半衰期，降低免疫原性是一个矛盾。增加PEG修饰程度，可以增加酶在 体内的半衰期，降低免疫原性，但是，随着PEG修饰度的增加，往往会导致活性的急剧下降， 甚至丧失(Yuying Tan，Protein Expression and Purification，12：45-52(1998))。如何寻找一 个既可以保留或基本保留被修饰酶的活性，又可以增加酶在体内的半衰期，降低免疫原性的 制备方法，是人们一直在努力寻找的目标。