[发明专利]活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，属于发育生物学和海水养殖技术领域。

背景技术

自20世纪80年代以来，经济蟹类(中华绒螯蟹、锯缘青蟹、远海梭子蟹和三疣梭子蟹等)养殖在我国迅速发展，据统计2007年全国蟹类养殖总产量近70万吨，我国的蟹类养殖已经取得举世瞩目的成就。蟹的主要可食部分为肌肉、卵巢和肝胰腺，其中卵巢具有较高的营养价值。因此在蟹类养殖生产中，卵巢发育良好的雌蟹，俗称红膏蟹，经济价值比卵巢发育差的雌蟹要高很多。另一方面，雌蟹卵巢发育的好坏直接影响着雌蟹的生殖能力，在蟹类育苗中需要挑选卵巢发育良好的雌蟹作为亲本，这对于蟹类育苗生产显得十分重要。此外，研究蟹类卵巢发育一直是甲壳动物发育生物学上的一个重要的研究内容。因此，判断蟹类卵巢发育情况对于了解其发育生物学、育苗、养殖和商品蟹流通均具有重要的理论意义和现实意义。

对虾类的卵巢位于半透明的头胸甲内，通常通过肉眼即可观察甲壳内的卵巢发育情况，蟹类的卵巢位于不透明的头胸甲内，故肉眼难以观察。经验的判断方法是，在一定光照条件下观察蟹的卵巢是否充满头胸甲，如果卵巢充满头胸甲，则说明卵巢发育较成熟，但是这种方法的准确性较差，且不可对卵巢组织取样进行深入的研究。

判断卵巢发育情况较为可靠的方法是解剖雌蟹，取出卵巢观察发育情况，但这样就必须杀死雌蟹，故这种方法在育苗生产和商品蟹销售过程中并不可取。我们先前的技术“采用微型电钻钻孔，然后用镊子活体直接取出少量组织，最后密封穿刺孔”，那种取样方法对主要适用于卵巢发育成熟(五期)的蟹，而且对蟹的伤害较大，容易产生的应激反应，例如停食和躁动等，从而导致蟹体内发生一系列生理变化(如血糖和雌二醇等含量升高)，甚至造成蟹的应激死亡。由于那种采样方法会导致卵巢发育至三期的雌蟹卵巢停止发育，因此那种方法仅适合于检查卵巢发育成熟或者接近成熟的雌蟹，了解其卵巢发育情况，从而预报其产卵期，不适合于研究卵巢发育早期(四期之前)的蟹。本发明通过使用穿刺技术较好的解决了这一问题，能够精确取样卵巢发育早期(三期)的卵巢组织，而且对蟹的伤害小，不会影响蟹的卵巢进一步发育，所取的卵巢组织可以用于多种生物学研究，如组织学、激素测定、生物化学和分子生物学等。

此外，在以往的科研工作中，为了计算蟹的卵巢指数，首先需要称重蟹的体重，然后处死蟹，再解剖取出所有卵巢组织，最后称重卵巢，根据这些来计算卵巢指数(％)＝100×卵巢重量/雌蟹体重。由于亲本蟹价格昂贵，显然处死亲本蟹的方法不仅增加了科研成本，而且也无法满足对同一个体不同卵巢发育阶段进行连续采样的需要，同时还不利于动物福利的开展。

以往解剖蟹对卵巢组织进行取样步骤繁琐，操作过程耗时较长，对于提取RNA等分子生物学实验不利，稍有不慎便会使RNA降解，导致实验失败。同时解剖过程中，蟹的应激反应会导致蟹体内生理指标的产生变化，对于激素测定结果会造成较大不良影响。而采用穿刺技术对蟹卵巢组织进行采样，不仅操作简便和迅速，而且对蟹伤害小，能避免这些不良影响。

远海梭子蟹(Portunus pelagicus)又称远洋梭子蟹，属于暖水性蟹类，主要分布在我国福建、台湾、广东和广西海域，该蟹最大个体达187mm，可食用部分大、营养丰富，是一种优质的经济蟹类；另一方面，该蟹生长迅速、繁殖能力强、抗病能力强、卵巢发育周期短、在适宜条件下可以全年连续产卵，所以该蟹具有广阔的养殖前景，同时又可以作为研究蟹类卵巢发育的模式动物。因此，本实验室利用远海梭子蟹作为实验动物，建立了活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，且通过实践验证了其可行性。

发明内容

本发明采用活体穿刺技术在活蟹体内取出少量卵巢组织，然后用小塑料板和502胶迅速封住穿刺留下的穿刺孔，这样极大减少了采样对于蟹造成的伤害，能保证采样后蟹卵巢正常发育。本方法克服了“采用微型电钻钻孔，然后用镊子活体直接取样”容易造成“对蟹的的伤害大，造成较强应激反应，仅是适合于研究卵巢发育晚期的蟹”等缺陷。活体穿刺技术取样不仅对蟹的伤害小，而且可以取样发育早期的卵巢组织，也可以对同一个体进行连续采样等。该方法简单易行，适合于科研和生产单位使用，在活体条件下了解亲本的卵巢发育情况，以及分析卵巢发育不同时期激素含量，抽提DNA和RNA等对样品进行分子生物学研究。该技术适用于远海梭子蟹、三疣梭子蟹、中华绒螯蟹和锯缘青蟹等蟹类。