[发明专利]将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的DNA处理方法，具体是一种将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法。

背景技术

单分子测序的基本操作是：用一个带有单个纳米孔传感器的薄膜将电泳槽分为两极，在负极电泳液中，将一条被测核酸片段的一端固定在一个支持物上，用核酸外切酶从自由端逐个降解核酸的组分(4种碱基)，它们在中性至微碱性pH下带负电荷，在外加电场作用下，被释放的碱基按原来在核酸上的顺序依次从负极向正极移动时通过纳米孔，因4种碱基的分子量和三维结构不同，所以，在穿越纳米孔时，对离子流的阻碍程度和穿越时间就会不同，膜片钳记载各碱基留下的特异性电信号-“笔迹”，从而获得目的片段的序列信息。但如何有效地将目的片段放置到电泳槽中，一直没有非常有效的方法。

经对现有文献检索发现，Dapprich，J.&Nicklaus等在《生物成像》上发表了“通过监控珠子移位将DNA连接到被光学捕获在微结构的珠子上”一文(Dapprich，J.&Nicklaus，N.DNA attachment to optically trapped beadsin microstructures monitored by bead displacement.Bioimaging 6：25～32(1998))，文中评述：他们的研究结果可获得一个磁珠只连接一个核酸片段。但该方法需要光学镊等设备，步骤比较繁琐，效率也比较低。因此，本发明要要解决的技术问题是如何方便地将目的片段固定，进而放置到电泳槽中。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法。本发明的方法可以获得目的片段序列信息，与阵列技术结合，可以提高测序通量；可实现DNA的单分子测序；将纳米孔制作成阵列，与诱饵阵列配合，可提高测序通量。

本发明是通过以下技术方案实现的，

本发明涉及一种将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法，包括如下步骤：

步骤一，将DNA荧光标记，之后进行如下操作：在DNA的3’端标记生物素，5’端标记地高辛；或者在DNA的3’端标记地高辛，5’端标记生物素；

步骤二，将DNA置于表面用抗地高辛被覆的玻璃上进行免疫反应，流水；或将DNA置于表面用抗链霉生物素被覆的玻璃上进行免疫反应，流水洗涤；

步骤三，如果步骤二是地高辛-抗地高辛免疫反应，则将抗链霉生物素被覆的磁珠添加到玻璃表面，进行第二次免疫反应；如果步骤二是生物素-抗链霉生物素免疫反应，则将抗地高辛被覆的磁珠添加到玻璃表面，进行第二次免疫反应；

步骤四，将DNA内切酶加到磁珠周围，待DNA分子被降解后，用微枪尖逐一收集携带短片段DNA的磁珠，并将其置于磁铁上；

步骤五，利用DNA内切酶切割目的DNA，在连接酶作用下，将目的DNA片段与磁珠上的DNA片段连接。

步骤一中，所述荧光标记为花青类染料、吲哚类染料、咪唑类染料、菲锭类染料或双链DNA染料。

步骤一中，所述荧光标记为YOYO-1、溴化乙锭、Hoechst 33342或7-AAD。

步骤三中，所述磁珠为微米磁珠或纳米磁珠。

步骤四中，在加入DNA内切酶前，利用磁棒旋转磁珠，去除连接≥2条DNA分子的磁珠。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：用高分辨率纳米孔作传感器，在保持被外切酶释放的碱基按顺序进入纳米孔条件下，可以获得目的片段序列信息，与阵列技术结合，可以提高测序通量。将携带目的片段的磁珠，用电磁力、光学镊或纳米定位器控制住DNA的行进速度，与纳米孔结合，可实现DNA的单分子测序；将纳米孔制作成阵列，与诱饵阵列配合，可提高测序通量。

附图说明

图1为核酸单分子操作示意图。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

步骤一，将DNA用YOYO-1荧光标记，之后在DNA的3’端标记生物素，5’端标记地高辛；

步骤二，将DNA置于表面用抗地高辛被覆的玻璃上，使DNA的5’端与玻璃表面的抗地高辛发生免疫反应而固定在表面，流水洗去未被固定的DNA分子；