[发明专利]人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种制备人重组Reg4蛋白的方法，其中的人重组Reg4蛋白为如下(a) 或(b)的蛋白质：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；

(b)(a)中的氨基酸序列经过一个氨基酸突变衍生的如SEQ ID NO：3所示 的蛋白质，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一，构建含有编码人重组Reg4蛋白DNA的重组表达载体；

步骤二，制备含有步骤一所得重组表达载体的转化体；

步骤三，培养转化体，表达蛋白；然后将大肠杆菌破菌并收集包涵体，包涵 体用Pellet Wash Buffer洗涤后，溶解至盐酸胍变性溶液中，然后再将盐酸胍 变性溶液加入到复性液中，得到复性后的人重组Reg4蛋白溶液；其中，所述复 性液的组分及含量为：1L复性液的组分及含量为：Tris 6.057g，KCl 0.7455g， NaCl 14g，MgCl₂0.4g，CaCl₂0.3g，Guanidine-HCL 47.76g，Sucrose 136.92g， Arginine-HCL 105.35g，GSH 300mg，GSSH 60mg，余量为水；

所述复性后的人重组Reg4蛋白溶液中人重组Reg4蛋白浓度为0.1mg/ml， 对得到的复性后的人重组Reg4蛋白溶液进行如下处理：4℃静置过夜，12000rpm 离心30min，得上清，将上清pH值调至8.0，再离心12000rpm离心30min， 收集上清；之后将上清用与上清等体积的pH为7.2的磷酸缓冲液稀释，之后用 膜包去盐去水至稀释后总体积的1/10，再用pH为6.5的磷酸缓冲液将去水后得 到的溶液稀释10倍；

步骤四，纯化蛋白，得到人重组Reg4蛋白；

所述纯化为阳离子交换柱纯化，具体为：

i)用pH为6.5磷酸盐缓冲液清洗管路及阳离子交换柱，直至电导与UV 值平衡；

ii)上样，控制流速为1ml/min；

iii)用pH为6.5的含有1M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白；

iv)收集流穿液。

2.根据权利要求1所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，步骤一 中，所述DNA的序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，步骤一 中，所述重组表达载体为pET30a质粒。