[发明专利]人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法，属 于基因工程技术领域。

背景技术

Reg4蛋白能促进几种肿瘤细胞的增殖和生长，在结肠癌、胃癌、胰腺癌和 前列腺癌，以及炎症性肠病中表达明显升高。人Reg4基因(NM_032044.2)1285bp， CDS长度477bp。CDS前面66bp编码一长度为22个氨基酸的信号肽。信号肽不 包含在分泌出来的Reg4内。但Reg4在生物体内含量很少，且难以纯化。目前尚 无有具有生物活性的人重组Reg4蛋白报道或上市。我们实验室发展出一种在大 肠杆菌中直接表达并纯化成熟形式的人重组Reg4的方法，并在体外检测了重组 Reg4蛋白的生物学活性。采用我们的方法纯化出来的人重组Reg4具有纯度高、 内毒素含量低、活性强的优点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有现有技术的不足，提供一种人重组Reg4蛋白及 其编码基因以及该蛋白的制备方法。本发明所提供的人重组Reg4蛋白为直接具 有活性的形式，制备方法简单、成本低廉，蛋白产品纯度达到98％以上，内毒素 含量低，活性高。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

第一方面，本发明涉及一种人重组Reg4蛋白，该蛋白为如下(a)或(b)的蛋 白质：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；

(b)(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有肿 瘤细胞促增值活性的由(a)衍生的蛋白质。

第二方面，本发明涉及一种编码上述人重组Reg4蛋白的DNA序列，序列如 SEQ ID NO：2所示。

第三方面，本发明涉及一种制备上述人重组Reg4蛋白的方法，包括如下步 骤：

步骤一，构建含有编码人重组Reg4蛋白DNA的重组表达载体；

步骤二，制备含有步骤一所得重组表达载体的转化体；

步骤三，培养转化体，表达蛋白；

步骤四，纯化蛋白，得到人重组Reg4蛋白。

步骤一中，所述DNA的序列如SEQ ID NO：2所示。

步骤一中，所述重组表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

步骤一中，所述重组表达载体为原核表达载体。

步骤一中，所述重组表达载体为pET30a质粒。

步骤二中，所述转化体为大肠杆菌。

在步骤三之后和步骤四之前还包括如下步骤：将大肠杆菌破菌并收集包涵 体，包涵体用Pellet Wash Buffer洗涤后，溶解至盐酸胍变性溶液中，然后再 将盐酸胍变性溶液加入到复性液中，得到复性后的人重组Reg4蛋白溶液；其中，

所述复性液的组分及含量为：1L复性液的组分及含量为：Tris 6.057g，KCl 0.7455g，NaCl 14g，MgCl₂0.4g，CaCl₂0.3g，Guanidine-HCL 47.76g，Sucrose 136.92g，Arginine-HCL 105.35g，GSH 300mg，GSSH 60mg，余量为水。

优选地，所述复性后的人重组Reg4蛋白溶液中人重组Reg4蛋白浓度为 0.1mg/mL。

对得到的复性后的人重组Reg4蛋白溶液进行如下处理：4℃静置过夜，12000 rpm离心30min，得上清，将上清pH值调至8.0，再离心12000rpm离心30min， 收集上清；之后将上清用与上清等体积的pH为7.2的磷酸缓冲液稀释，之后用 膜包去盐去水至稀释后总体积的1/10，再用pH为6.5的磷酸缓冲液将去水后得 到的溶液稀释10倍。

所述纯化为阳离子交换柱纯化，具体为：

步骤一，用pH为6.5磷酸盐缓冲液清洗管路及阳离子交换柱，直至电导与 UV值平衡；

步骤二，上样，控制流速为1ml/min；

步骤三，用pH为6.5的含有1M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白；

步骤四，收集流穿液。

所述阳离子交换柱为S/CM柱。