[发明专利]乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及乙型肝炎病毒的体外表型研究技术领域，具体涉及乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建。

背景技术

在我国乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要原因。HBV复制是通过逆转录过程来实现，在此过程中最易发生变异。近年来，随着抗病毒药物和疫苗的应用推广，由于病毒变异而出现的耐药和免疫逃逸问题越来越引起人们的重视。对HBV变异株的临床分离株进行表型研究是HBV变异研究的重要手段。

HBV变异株的体外表型研究以细胞模型应用的最为广泛。细胞模型研究方法又包括载体介导和非载体介导的短暂细胞转染和稳定转染细胞系的构建，其中非载体介导的短暂细胞转染虽然具有方便、快速的优点，但转染后HBV复制效率较低，难以在试验室广泛应用。载体介导的短暂细胞转染和稳定转染细胞株在当今的HBV表型研究中较为多见，其中HBV可复制型质粒的构建是上述两种方法的基础。目前国内外应用较多的HBV复制型质粒多为来源于法国和美国试验室的1.1-HBV的载体，但是在载体上启动转录的元件都是外源启动子和POLYA信号，具有一定的局限性：(1)外源元件对于HBV复制和表达的影响不清楚；(2)HBV的启动子并不是严格的保守区域，临床常见的1762和1764位的变异就发生在启动子区，1.1-HBV的载体无法对以上区域的变异进行表型研究。并且国内已有的复制型质粒其HBV病毒株多来源于国外标本，其血清型和基因型和国内病毒株有较大差别。因此，利用来源于中国的临床标本中构建HBV复制性质粒在当今有着重要的应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有病毒自身遗传学特性的HBV复制型质粒的构建方法，具有高效率、高稳定性的特点。

为实现上述发明目的，本发明公开如下技术方案：

一种乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法，包括(1)HBV全长基因组的抽提、PCR扩增和克隆构建；(2)重组过渡载体的构建；(3)重组过渡载体的酶切与去磷酸化；(4)复制型质粒的构建，所述重组过渡载体由三个连接片段同时定向连接，两个插入的HBV片段之间形成两个反向的BspQI酶切位点，使用SOC培养基进行HBV全长基因组克隆和复制型质粒的菌落培养扩增。

所述重组过渡载体包含HBV完整的EnhI、EnhII、复制和转录起始点，重组过渡载体去磷酸化后进行一次自身连接和转化。

步骤(1)中PCR产物纯化后经末端加A，将全长基因组片段插入TOPOXLPCR载体；步骤(3)中重组过渡载体的酶切使用BspQI内切酶。

本发明具有以下有益效果：

(1)目前HBV全长基因组克隆技术存在着克隆构建效率低下和插入的基因组片段不稳定的问题，本发明采用了TOPOXLPCR克隆构建技术，使用了可容纳＞3kb的长片段插入的XL-TOPO载体，提高了克隆构建效率。

(2)关键酶的酶切效率提高。现有技术中SapI内切酶的使用是所有HBV克隆构建试验技术的关键，但这种内切酶酶切效率低下，易受外界反应条件干扰，是目前克隆构建技术中难以突破的瓶颈问题。本发明以BspQI内切酶代替SapI内切酶，成功解决了上述问题，极大提高了试验进程。

(3)目前尚没把SOC培养基应用于质粒扩增的记录，以高营养的SOC培养基取代传统的LB培养基进行菌落培养扩增，保证了质粒在扩增过程中的稳定性。

(4)重组过渡载体包含了HBV完整的EnhI、EnhII、复制和转录起始点，增加了病毒的复制效率。

(5)重组过渡载体去磷酸化后进行一次自身连接和转化，以保证去磷酸化效率。

本发明在技术上具有操作方法简捷，克隆构建效率高，结果稳定，由于采用了HBV自身复制转录起始点和调控元件，产生的HBV复制型质粒具有病毒自身的遗传学特性，可代表病毒自身的转录复制特性，并且可对中国的HBV临床分离株进行全面综合的全基因组表型研究。

附图说明

下面结合说明书附图，对本发明进一步详细说明。

图1：两段PCR扩增区域示意图。

图2：过渡载体插入片段示意图。

图3：HBV全长基因组插入过渡载体示意图。

具体实施方式

实施例1

(1)HBV全长基因组的抽提、PCR扩增和克隆构建。采用病毒基因组抽提试剂盒提取HBV DNA，PCR扩增全长基因组，在扩增引物中同时加入BspQI和XbaI两个酶切位点，引物如下：