[发明专利]一种用甲醇酵母制备抑肽酶衍生物的新方法

权利要求书

1.一种用甲醇酵母制备抑肽酶衍生物等的新方法，其特征在于包括以下步骤：

1)合成抑肽酶衍生物融合蛋白的cDNA；

2)将所述cDNA在甲醇酵母中的分泌表达；

3)分离纯化抑肽酶衍生物融合蛋白；

4)用酶或化学物质裂解融合蛋白及抑肽酶衍生物的纯化。

2.根据权利要求1涉及的抑肽酶衍生物可以是人源的，也可以是牛源的。第52位氨基酸可为其它任何氨基酸(包括Ile、Leu和Glu等)或仍为Met。第15位氨基酸也可以被其他任何氨基酸替换。也可以在N多出一个氨基酸如，Pro-aprotinin(SEQ ID NO：6)或Gly-aprotinin(SEQ ID NO：9)等。

3.根据权利要求1涉及的抑肽酶衍生物等，不局限于抑肽酶衍生物，也可以是其它蛋白，如表皮生长因子等。

4.根据权利要求1涉及的抑肽酶衍生物融合蛋白，是指抑肽酶衍生物N端融合一段多肽和蛋白质。

5.根据权利要求4涉及的融合蛋白可在甲醇酵母表达系统高效表达，也包括其他表达系统例如原核表达系统、真核表达系统、昆虫表达系统、植物表达系统和其他的酵母表达系统。

6.根据权利要求4涉及的多肽或蛋白质可以是凝胶蛋白、水蛭素或血清白蛋白等可在相应的系统高效表达的蛋白或它们的片段等。

7.根据权利要求4涉及的多肽或蛋白质的内部或两端可插入6×His。

8.根据权利要求1获得的融合蛋白可用金属螯合层析的方法纯化。

9.根据权利要求4涉及的融合蛋白，在N端多肽或蛋白质和抑肽酶或其衍生物之间有酶或化学物质的切割位点，切开后制备的抑肽酶或其衍生物的N端不会有新的氨基酸，与天然抑肽酶的N端完全一致，如有新的氨基酸，但不影响其生物活性。

10.根据权利要求9涉及的切割方法可以是酶包括TEV酶、凝血酶和肠激酶等，也可以是化学物质包括酸水解、溴化氰和Hydroxylamine等。

11.根据权利要求1制备的抑肽酶衍生物在多方面的药物中应用，如在外科用于止血、抑制炎症，治疗休克；治疗胰腺炎、肺气肿和喘息性支气管哮喘，治疗急性关节炎，抗病毒和恶性肿瘤等。