[发明专利]一种用甲醇酵母制备抑肽酶衍生物的新方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种用甲醇酵母表达制备抑肽酶衍生物的新方法。

背景技术

上世纪三十年代，人们从牛肺中分离了一种抑制激肽释放酶(kallikrein)的物质，后来发现这是牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)。早在1959年德国首先以商品名为Trasylol^@上市用于治疗胰腺炎。1987年外国科学家偶然发现了Trasylol^@具有非常显著的止血作用。牛胰蛋白酶抑制剂是一种很强的广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂，它可以抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤维蛋白溶酶和血浆激肽释放酶等，人们又称之为抑肽酶(aprotinin)。天然抑肽酶是由58个氨基酸残基组成的单链多肽，有三对二硫键，其活性中心位于15位赖氨酸。

抑肽酶具有抑制纤溶系统的激活、保护血小板的功能、止血和抑制炎性反应等多种作用，是一种很有价值的药物。抑肽酶是国家基本医疗保险药品中之一，首次收载于中国药典(90版)。抑肽酶在预防和治疗各种出血，如纤溶系统亢进引起的出血、外伤引起的出血性休克和产后大出血等，尤其在心脏直视手术中，能使术中、术后出血量减少一半以上(30％-100％)，缩短手术时间，减少术后并发症(感染等)发生率，减少可能由输血引起病毒(爱滋病、肝炎)感染的危险性。此外，抑肽酶还可用于其他疾病的治疗，如急、慢性胰腺炎、肺气肿、喘息性支气管哮喘的首选药物，也用于胸、腹膜粘连的预防；还有抑制胶原酶的作用，治疗急性关节炎疗效极佳；近来，在抗病毒、抗癌症方面治疗作用的研究报道越来越多，显示出非常广阔的应用前景。

目前临床上使用的抑酶肽都从牛胰或牛肺中提取，价格昂贵，这使得它的应用受到一定的限制。尽管如此，国内心胸外科和胰腺手术仍广泛使用抑肽酶，仅阜外医院每年进口的抑肽酶用量就价值约400万人民币(参见中国专利0113609.1)。

近年来，疯牛病蔓延到许多国家，这使得抑肽酶的原料来源大大减少，况且从牛胰或牛肺提取的抑肽酶成本高，质量不稳定，还有潜在疯牛病的危险。

抑肽酶是由58个氨基酸残基组成的单链多肽，从理论上是可以用基因工程重组的方法制备，国外也有文献和专利报道。(参见美国专利：4,894,436、5,258,302、5,164,482；5,591,603、5,707,831；中国专利：95106042.2，96120494.x，97115348.5)。他们企图用大肠杆菌表达系统或酵母表达系统来表达。但是大肠杆菌胞内表达容易形成包含体，变复性也十分困难，收率很低，大肠杆菌分泌表达，表达量低。酵母表达存在严重的N端不均一的问题。Vedvick等人曾报道抑肽酶发酵表达量可达0.93克/升，其生物活性也和天然的抑肽酶一样，很遗憾的是：其表达产物N端不均一，有的N端会多2个额外的氨基酸，有的多4个额外的氨基酸，有的多11个额外的氨基酸，这些产物在在理化性质上非常相似，很难被分离开来，即使分离开，收率也很低。

国内也有人从事这方面的研究，如甘肃大得利生化制药厂，他们用细菌表达系统表达，表达量低；还有中国药科大学用包涵体表达，需要复性，收率低。

本专利描述了用甲醇酵母表达系统，以分泌的方式高效表达融合蛋白，然后在用酶或者化学方法切开，从而得到N端均一的抑肽酶衍生物。

发明内容

本发明的目的提供一种基因工程方法生产、表达量高、高纯度的抑肽酶衍生物的新方法。这种抑肽酶衍生物具有完全的天然抑肽酶的生理活性。

本发明提供的抑肽酶衍生物的制备新方法包括以下步骤：

1.抑肽酶衍生物N端延伸融合蛋白的构建

经过大量查阅文献资料，我们找到几种在甲醇毕赤酵母中高效表达的蛋白，例如，凝胶蛋白(gelatins)、醇氧化酶、血清白蛋白和水蛭素等，我们将其中的一种蛋白放在抑肽酶衍生物的N端之前，中间用连接肽相连。连接肽和抑肽酶之间加上切割位点。在融合蛋白切割位点之前的任何位置，可以插入组氨酸，组氨酸可以是一个或多个，可以连在一起或者分散插入。

2.合成对应于抑肽酶衍生物N端延伸融合蛋白的cDNA

按照甲醇酵母喜好的密码子设计并人工合成融合蛋白cDNA(APN fusionDNA)。

3.融合蛋白基因工程菌的构建

将APN fusion DNA重组到甲醇酵母分泌表达载体，用单酶切方法线性化，然后转化甲醇酵母宿主菌，外源基因整合到宿主菌的染色体上，用适当的抗性筛选阳性克隆，然后进行增殖和表达筛选，从而得到高表达的基因工程菌(APNfusion)。

4.基因工程菌(APN fusion)高密度发酵