[发明专利]一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法

权利要求书

1、一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该序列具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的序列，其特征在于：所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

3、一种权利要求1所述的来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤：

(1)总RNA的提取和纯化：

采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物垫状卷柏叶片中提取得到纯化的垫状卷柏叶片总RNA；

(2)中间片段的克隆：

A、中间片段cDNA第一链的合成

以上述步骤(1)纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以oligod(T)18：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3′为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的cDNA模板；

B、PCR扩增

以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为cDNA模板，利用下述上游引物jf1和下游引物jx1，进行PCR扩增：

jf1：5′-TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG-3′，

jx1：5′-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3′；

扩增得到垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列；

(3)3′端的克隆：

以前述步骤(2)A中得到的cDNA第一链为模板，利用下述上游引物S1和下游引物AP2进行PCR扩增：

S1：5′-GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3′，

AP2：5′-TACGTACGGCATG ACAGTG-3′；

扩增得到完整的3′端，通过克隆测序，得到3′端序列；

(4)、5′端的克隆：

C、合成5′端的cDNA第一链：

以上述步骤(1)纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以下述下游引物jx1和上游引物SMARTIIA Oligo为反转录引物，进行反转录：

jx1：5′-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3′，

SMARTIIA Oligo：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′；

合成得到反转录产物5′端的cDNA第一链；

D、第一段PCR扩增：

以前述步骤C所得反转录产物5′端的cDNA第一链为cDNA模板，利用下述下游引物A2和同源上游引物C1，进行5′端第一段PCR扩增：

A2：5′-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3′，

C1：5′-ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3′；

扩增得到的产物为cDNA 5′端第一段，通过克隆测序，得到5′端第一段的序列；

E、第二段PCR扩增：

以前述步骤C所得反转录产物5′端的cDNA第一链为cDNA模板，利用下述下游引物A5和上游引物P3，进行5′端第二段PCR扩增；

A5：5′-GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3′，

P3：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′；

扩增得到的产物为cDNA 5′端第二段，通过克隆测序，得到5′端第二段序列；

(5)ORF的克隆和拼接：

将上述步骤(2)所得中间片段序列、步骤(3)所得3′端序列、和步骤(4)所得5′端第一段序列和第二段序列进行拼接，得到的cDNA全长作为ORF扩增的cDNA模板；

以下述上游引物ORF4和下游引物ORF5进行PCR扩增：

ORF 4：5′-CCCAAGCTT(HindIII)CCTCGAG(XhoI)ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC-3′，

ORF5：5′-CGC GGATCC(BamHI)ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3′；

扩增得到的产物为完整开放阅读框，即垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。