[发明专利]一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法。

背景技术

垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim)为卷柏科卷柏属植物，俗称“九死还魂草”。它一般多生长在荒山秃岭及干旱的岩石缝中，极耐干旱，也耐寒。在天气干旱的时候，小枝就卷起来，缩成一团，以保住体内的水分。一旦得到雨水，气温升高，卷缩的小枝会平展开来。有研究表明垫状卷柏这类复苏植物体内含有大量的应激代谢物-海藻糖。

海藻糖又称酵母糖，是由两个吡喃环葡萄糖分子通过α-1，1糖苷键连结而成的非还原性糖，其理化性质十分稳定，能够在高温、高寒、高盐和干燥失水等恶劣条件下对生物细胞起到保护作用。海藻糖作为渗透调节物质通过渗透调节来维持高的细胞质渗透压，保证在干旱胁迫下细胞的正常生理功能；在缺水情况下，可以保持细胞膜的液体流动相，防止细胞膜通透性增加，出现融合现象；可以替代水分子通过氢键作用参与肽链折叠，维持在缺水情况下蛋白质的空间结构和功能。

在生物体内，海藻糖的生物合成过程为：先由海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase，TPS)催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDP)和6-磷酸葡萄糖反应生成6-磷酸海藻糖，再在海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP)的作用下脱磷酸，最终生成海藻糖。其中，海藻糖-6-磷酸合成酶是该合成途径中的一个关键酶；不同生物体内的海藻糖-6-磷酸合成酶具有各自不同的特点，如在编码基因和结构等方面即存在着明显的差异。

目前人们研究海藻糖的主要策略之一，是通过对海藻糖上述合成途径相关基因的克隆与表达研究，增强其合成途径的代谢，从而实现海藻糖在生物体内的富集。其中海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)成为主要关注对象之一，许多科学家在此方面进行了不懈的努力。但目前，人们对大肠杆菌和真菌等体内TPS基因的研究与利用相对较多，对植物体内TPS基因的开发研究还非常有限。

发明内容

本发明的主要目的就是针对现有技术对植物体内海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因开发研究的局限性，提供一种来源于植物垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶的基因序列，以期待应用于其它转基因作物中使之具有相应的优良的抗旱耐盐等性能。

本发明的另一个目的是提供一种上述基因序列的克隆方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该序列具有如SEQID NO.1所述的核苷酸序列。

其所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

上述核苷酸序列，可通过包括下述步骤的方法，从植物垫状卷柏叶片中提取总RNA、设计引物、进行PCR扩增、测序等克隆得到：

(1)总RNA的提取和纯化：

可采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物垫状卷柏叶片中提取得到纯化的垫状卷柏叶片总RNA；

常用的RNA提取方法很多，如试剂盒法(Trizol法)、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法、及各种改进方法等，均可用于垫状卷柏叶片总RNA的提取；本发明中可优选Trizol法。

纯化主要是为了去除总RNA中的DNA污染，获得纯化的垫状卷柏叶片总RNA，以满足后续对目的基因的表达进行定量检测等需要。常用的RNA纯化方法包括：DNA酶消化法(简称D法)、酸酚变性法(简称S法)、EDTA法(简称E法)等；本发明中可优选DNA酶消化法。

(2)中间片段的克隆：

A、中间片段cDNA第一链的合成

以上述步骤(1)纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以oligod(T)18：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3′为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的cDNA模板；

B、PCR扩增

以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为cDNA模板，利用下述上游引物jf1和下游引物jx1，进行PCR扩增：

jf1：5′-TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG-3′，

jx1：5′-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3′；