[发明专利]奶牛和杂交牛脊椎畸形综合征PCR-RFLP检测方法

说明书

技术领域

本发明属于动物疾病检测技术领域，具体涉及一种牛隐性遗传疾病脊椎畸形综合征(CVM)检测领域。

背景技术

脊柱畸形综合征(complex vertebral malformation，CVM)，是荷斯坦牛的一种常染色体致死性隐性遗传病，1999年，丹麦科学家Agerholm等最先报道了该病的发生。CVM主要表现为纯合子胎儿的早期死亡，纯合子胎儿在出生后极少能够存活。但是CVM杂合子后代(携带者)表现正常，能够存活。患有CVM病症的犊牛在母牛妊娠的任何时期都会发生流产，受CVM感染的犊牛最显著的特征包括：颈短、脊椎畸形、心脏畸形、腿部畸形、系部呈现对称的内向僵直等。

人工授精技术和胚胎移植的广泛应用，使得CVM在全世界广为流传，并给奶业生产造成巨大损失，世界上奶业发达国家开始纷纷淘汰CVM携带者种公牛。目前，美国、加拿大、日本、和丹麦、英国等欧洲国家都要求荷斯坦种公牛必须进行CVM检测，并在公牛系谱中标明种公牛是否为CVM携带者。美国奶牛协会于2001年测定其荷斯坦牛群中CVM携带者约占10％左右，承认CVM为隐性不良基因，并规定经测定携带CVM基因的牛只用“CV”做标记，相应的正常牛只则标记为“TV”。

我国荷斯坦种公牛主要从美国、加拿大、德国，以及澳大利亚和新西兰等国家进口，我国过去使用和正在使用的荷斯坦种公牛中可能存在一定比例的CVM携带者，母牛群中也存在一定的比例(王帅等，2007)。我国针对该疾病而展开的工作刚刚起步，通过对致病基因的测定和对携带者的淘汰，将能适当降低该疾病的影响，但对隐性遗传病的诊断和对携带者的淘汰是一项长期艰巨的任务。

SLC35A3基因是引起奶牛发生脊椎畸形综合征的致病基因，定位于牛第3号染色体上。该基因全长14901bp，mRNA为981bp，由7个外显子和6个内含子组成，第四外显子559处G突变为T时，可发生脊椎畸形综合征或为致病基因携带者。编码核糖转运蛋白的牛SLC35A3基因，与脊柱发育有关。其第四外显子的一个碱基发生了突变(由G突变为T)，对应的氨基酸由缬氨酸转变为苯丙氨酸，从而导致脊椎畸形综合征。

传统方法往往是根据其后代的表型特征鉴定淘汰有害基因，其缺陷是选育周期长且准确性不高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，寻找一种简便有效的用于牛脊柱畸形综合征(CVM)检测的PCR-RFLP方法。

本发明是这样实现的：

一种牛隐性遗传疾病脊椎畸形综合征的鉴定方法，其步骤如下：

(1)从被检牛样本中提取牛基因组DNA。

(2)根据牛SLC35A3基因序列(GenBank登录号：AY160683)，利用生物学引物设计软件Premier 5，引入酶切位点的网站http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html，设计引入酶切位点的PCR扩增引物。引物序列详见具体实施方式中的实施例1。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。设计引入酶切位点的PCR扩增引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：

正向：5’GCTCTCCTCTGTAATCCCCA 3’，

反向：5’CCACTGGAAAAACATGCTGTGAGTA 3’。

(3)PCR反应扩增程序为：94℃变性3min，35次循环(94℃1min，65℃1min，72℃1min)，72℃延伸10min，得到PCR扩增产物。

(4)用2.5％琼脂糖凝胶电泳对步骤(3)的扩增产物进行检测，所述电泳条件为电压100V，时间为20min，染色，在凝胶成像系统中观察条带。

(5)取16μL PCR扩增产物，加入5URsa I限制内切酶和2μL 10×酶切缓冲液，加水至20μL，37℃，反应5h。

(6)反应完成后，在10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件为稳压100V，电泳时间为4h，银染，根据扩增产物的大小判定结果。使用PCR扩增得到含有G559-T559(等位基因突变)SNP位点的SLC35A3基因225bp的片段。由于扩增引物中引入了一个碱基的错配，产生了一个酶切位点，从而使致病突变的碱基可以被Rsa I识别。根据扩增产物的大小判定结果若出现225bp一条带，判定基因型为TT型；若出现201bp和24bp两条带，判定基因型为GG型；同时出现225bp、201bp和24bp三条带，判定基因型为GT型。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：