[发明专利]一种结核分枝杆菌全基因组ORF克隆文库的构建方法及应用

权利要求书

1.一种用于构建结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF克隆文库的细菌双杂交载体pTRG-MCMΔ，其特征在于，它是通过以下步骤获得的：

1)将购于invitrogen公司的细菌双杂交载体pTRG上211位点的XbaI酶切位点消除：先用XbaI对pTRG载体进行酶切，再用Klenow片段对酶切后线性载体的5’末端进行补平，并将线性载体自连环化，从而将211位点完整的XbaI酶切位点消除，获得一个中间载体pTRG-XbaIΔ；

2)将步骤1)获得的中间载体pTRG-XbaIΔ用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行消化；

3)利用极端嗜热古菌S.solfataricus的微型染色体维持基因MCM作为一个媒介基因，通过PCR的方法获得两末端分别含有EcoRI和XhoI酶切位点的MCM媒介基因；

4)将步骤3)获得的MCM媒介基因用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行消化；

5)将步骤2)获得的中间载体pTRG-XbaIΔ和步骤4)获得的MCM媒介基因在16℃的条件下连接过夜，得到中间载体pTRG-MCM；

6)将步骤5)获得的中间载体pTRG-MCM用限制性内切酶BamHI充分酶切；

7)将步骤6)酶切后的中间载体pTRG-MCM末端削平并自连接，获得改造的细菌双杂交载体pTRG-MCMΔ，其大小为5592bp，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

其中，步骤3)利用PCR扩增的MCM基因的引物对的序列如下所示：

正向引物：GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC；

反向引物：GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT。

2.一种构建结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF克隆文库的方法，其特征在于步骤如下：

1)利用PCR方法获得结核分枝杆菌H37Rv的全部编码基因：对结核分枝杆菌H37Rv全部编码基因内部的酶切位点进行分析，选择所有编码基因内部没有的酶切位点作为引物设计时的酶切位点，在设计引物时将所有基因分为六类，前五类基因分别在上游引物和下游引物中引入EcoRI和XbaI、NotI和XbaI、EcoRI和XhoI、NotI和XhoI、BamHI和XhoI，第六类采用连接头的方法在接头内引入EcoRI酶切位点，在下游引物内引入XbaI酶切位点，利用PCR对全部编码基因进行扩增，利用这种引物设计的PCR方法扩增结核分枝杆菌H37Rv全部编码基因；

2)将分为六类的基因扩增产物混合，分别与相对应的酶切组合制备的pTRG-MCMΔ载体连接，将连接产物脱盐后电转化到大肠杆菌DH10B，获得重组克隆，将含有重组克隆的大肠杆菌混合培养，得到重组质粒。