[发明专利]一种结核分枝杆菌全基因组ORF克隆文库的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域。具体涉及一种构建结核分枝杆菌全基因组ORF克隆文库的方法及应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种世界性的传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的疾病，目前全世界每年新增结核病患者800～1000万，每年死亡人数约200万(World Health Organization(2008)WHO Report 2008 Global Tuberculosis Control.)，它是全球重点控制的传染病之一。

蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用，结核分支杆菌也不例外。所以，系统地研究结核分支杆菌的蛋白质与蛋白质之间的相互作用不仅可以为全面了解结核分枝杆菌蛋白质之间的生理活动的关系提供依据；更重要的是，为揭示结核病的致病机理，寻找药物靶标及抗结核药物的研发提供理论基础。

研究蛋白质间相互作用的方法已有很多，如线晶体衍射、表面等离子共振、免疫共沉淀、交联技术、蛋白质探针、噬菌体展示、双杂交技术等。细菌双杂交技术(Dove，S.L.，and Hochschild，A.(2004)A bacterialtwo-hybrid system based on transcription activation.Methods Mol Biol 261：231-246.)是一种用于体内研究蛋白质之间相互作用的分子生物学的有力工具。细菌双杂交的原理是：在大肠杆菌中，如果相互作用的蛋白一个通过DNA结合域与DNA结合，另外一个与细菌RNA聚合酶(RNAP)的亚单位结合，那么只要其相互作用具有足够的强度便能够激活转录。因此，如果把“诱饵(Bait)”与序列特异性的DNA结合蛋白融合，而把“靶(prey)”与细菌RNAP的一个亚单位融合，那么“诱饵”与“靶”的相互作用便可以在启动子处征募RNAP并稳固其结合，激活报告基因的转录(Dove，S.L.，等，(1997)Activation of prokaryotic transcriptionthrough arbitrary protein-protein contacts.Nature 386：627-630.)。在该系统中，DNA结合蛋白通常为λ噬菌体抑制剂(λcI)，而RNAP亚单位一般为α亚基，报告基因可以是编码β内酰氨酶的bla和β半乳糖苷酶lacZ基因，也可以是参与组氨酸生物合成途径的HIS3基因和链霉素抗性基因aadA，但是后者具有筛选更大文库的能力(～10⁸以上)和更低的假阳性率(～3×10^-8)。近年来，细菌双杂交技术已应用于病原微生物基因产物功能和致病机制研究(Malek，J.A.，et al，(2004)Protein interaction mapping on a functional shotgun sequence ofRickettsia sibirica.Nucleic Acids Res 32：1059-1064.)。

目前，已有文献报导通过细菌双杂交筛选的方法发现了结核分枝杆菌中一些蛋白质与蛋白质之间的相互作用(Baulard，A.R.等，(2003)In vivo interaction between the polyprenol phosphate mannose synthase Ppmland the integral membra

发明内容

本发明的目的是构建一种结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF的细菌双杂交克隆文库，利用该文库进行细菌双杂交筛选，用于研究结核分枝杆菌蛋白质之间的相互作用，为揭示结核病的致病机理，寻找药物靶标及抗结核药物的研发提供实验依据和方法。

本发明的技术方案如下：

为了实现本发明，申请人改造了一个适用于构建结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF的细菌双杂交克隆载体pTRG-MCMΔ，利用PCR方法扩增结核分枝杆菌H37Rv全部编码基因，并将全部编码基因克隆到细菌双杂交克隆载体pTRG-MCMΔ，转化到大肠杆菌DH10B宿主细胞中，最终构建得到完整的结核分枝杆菌H37Rv的细菌双杂交克隆文库。利用该文库进行了初步的细菌双杂交筛选，筛选结果证明了该文库可以有效地用于研究结核分枝杆菌H37Rv蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

本发明的步骤是：

1)结核分枝杆菌H37Rv全部编码基因的扩增