[发明专利]类鼻疽检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1，一种类鼻疽假单胞菌的检测试剂盒，该试剂盒包括：

酶联板：一块，酶联板的包被：将单克隆抗体3#用碳酸盐缓冲液稀释到5μg/ml，100μl/孔包被反应板，4℃冰箱中孵育过夜，洗涤液洗涤两次，加入125μl/孔的封闭液的牛血清白蛋白，室温放置8个小时，丢掉封闭液，37℃烤箱8个小时后封板，得到预包被反应板；

酶标抗体：1×20ml/瓶，酶标抗体的制备，称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟，将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH 4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化程RP的PH升高到9.0～9.5，然后加入10mg IgG在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/ml NaBH₄液，混匀，再置4℃ 2小时，将上述液装入透析袋中，PBS透析，4℃过夜；

检测液A：1×10ml/瓶，检测液B：1×10ml/瓶；

浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍，浓洗涤液的配制：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L，向烧杯中加入约40ml的去离子水，搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH值调节至8.0，然后加入去离子水将溶液定容至50ml；

终止液：1×10ml/瓶，终止液：量取20ml 98％ H₂SO₄，加至80ml双蒸水中。

2、权利要求1所述的一种试剂盒在制备检测类鼻疽假单胞菌中的方法，其步骤是：

1)、ELISA试剂使用前试剂的配制：

LB液体培养基：LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加水至1L，5ml/支分装到的试管中，高压下蒸气灭菌消毒；庆大霉素和粘杆菌素的配制：用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存；

2)、取5ml/支LB试管，分别加入庆大霉素和粘杆菌素到100μg/ml；

3)、取临床样品1g加入试管中，37℃ 150rpm/min 24hous；

4)、取100μl培养液上清用于检测；

5)、酶联板加样：每孔加入100μl待测菌液，设阴性对照孔，置37℃ 60min；洗液冲洗五次；

6)、酶标：加入100μl酶标抗体，37℃ 30min后洗液冲洗五次；

7)、显色：每孔加底物溶液各一滴显色：检测液A与检测液B，置室温37℃15min；

8)、终止：每孔加终止液50μl。