[发明专利]高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法

权利要求书

1.高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，其特征在于包括下述步骤：

第一步：未分级肝素钠溶液的制备

①提取

将肠粘膜加2-3倍水于反应罐中以蛋白酶酶解，蛋白酶的用量为肠粘膜重 量的5-8％，酶解温度50-55℃，pH8.0-9.5，酶解时间3-5小时，酶解完毕， 过滤，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量3-4倍的碱性阴离子交换树脂 搅拌吸附，第一次吸附6-10小时，滤出树脂后，再加入树脂搅拌吸附5-8小 时，过滤，合并两次树脂，弃去滤液；

②除杂

将所得树脂置于1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中搅拌40-45分钟，滤出 树脂；

③洗脱

将树脂置于洗脱罐中，以树脂体积2-3倍量的浓NaCl溶液进行梯度洗脱， 第一次以4.0-4.5mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱时间6小时，第二次第三次分 别用3.0-3.5mol/L的NaCl溶液洗涤3小时，合并三次洗脱液；

④过滤

调整洗脱液pH值至11-12，过滤，滤液再调pH至7.0-7.5，即可得未分 级的肝素钠溶液；

第二步：未分级肝素钠溶液的分离纯化

①肝素酶酶切降解

在所制得的未分级肝素钠溶液中按每g肝素酶中加入12.5L肝素钠溶液的 比例加入固相化的肝素酶，缓慢搅拌40-50分钟，高速离心分离除固相化肝素 酶，得酶切降解后的肝素钠溶液；

②第1次超滤

将所得肝素钠溶液用截留分子量15K的超滤膜超滤，得超滤液I；

③胰酶酶解

将超滤液I升温至50℃，加超滤液重量0.1-0.5％的胰酶，调pH值至6.5 -8.5，恒温酶解3小时，然后升温至90℃，冷却后过滤，得滤液；

④第2次超滤

将所得滤液，用截留分子量10K的超滤膜超滤，收集超滤液II；

⑤第3次超滤

将超滤液II用截留分子量4K的超滤膜超滤，以超滤液1-2倍的纯水冲洗 2次，分别收集截留液和超滤液III，将截留液冷冻干燥，即得低分子肝素钠；

⑥第4次超滤

将超滤液III用截留分子量3K的超滤膜超滤，以超滤液2-3倍量的纯水冲 洗3次，收集截留液并冷冻干燥，即可得分子量为3000-4000的肝素钠。

2.根据权利要求1所述的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，其特 征在于：所用的蛋白酶是碱性2709蛋白酶。

3.根据权利要求1或2所述的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法， 其特征在于：所用的碱性阴离子交换树脂是PUROLITE Z-3。

4.根据权利要求1所述的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，其特 征在于：所用的碱性阴离子交换树脂的处理方法如下：a.将树脂放在容 器内用40-50℃热水浸泡4-5小时，再用热水冲洗3-5次；

b.用含重量百分比为10-12％NaCl的80-90°乙醇浸泡18-20小时，抽干， 再用40-50℃的热水反复冲洗3-5次；

c.将树脂投入到洗脱罐中，按照1∶1的比例加入质量百分比为7-9％的 氢氧化钠溶液浸泡并搅拌3小时左右，然后用清水冲洗至中性；

d.将树脂投入到洗脱罐中，按照1g树脂∶1g5mol/L盐酸的比例加入浸 泡并搅拌3-4小时；

e.放出盐酸液，再加入2倍于树脂量质量百分比为25％的NaCl溶液搅拌 2-3小时，放出NaCl溶液，用清水冲洗3-5次，即可。

5.根据权利要求1所述的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，其特 征在于：所述第1次、第2次超滤压力均为0.18MPa，第三次超滤压力为 0.14MPa，第四次超滤压力为0.12MPa，四次超滤温度均为22-26℃，超滤膜 均采用聚砜膜。

6.根据权利要求1所述的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，其特 征在于：所用的胰酶是由新鲜猪胰脏搅碎后，于90％的乙醇中常温激活13-15 小时制得。