[发明专利]高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法

说明书

(一)技术领域：本发明涉及一种生物药用原料的分离纯化方法，具体 是高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法。

(二)现有技术：肝素钠自1916年Molean发现其良好的抗凝作用以来， 历经半个多世纪，作为一种重要的生化药物而被广泛地应用在医药临床上。 肝素钠不仅具有抗凝、抗血栓、抗炎、抗过敏、抗病毒和降血脂等多种生物 功能，同时也是一种防治深部静脉血栓、肺血栓或其他血栓的有效药物。

近几年来，肝素钠广泛应用于美容、保健等其它领域中，有改善局部血 液循环，及消炎、消除青春痘、润肤、软化疤痕等作用。目前我国抗血栓药 物中肝素类占有最大的市场份额(39％)，在肝素类中低分子肝素又占整个抗血 栓类药物27％的市场份额。肝素在临床应用时常伴有出血、血小板减少，骨 质疏松等副作用。但到目前为止，尚无一种能够完全替代它的产品，尽管存 在以上副作用，但在临床上它仍然是预防手术后血栓形成和治疗急性静脉血 栓的首选药物。为了减轻肝素的副作用，人们采取了各种方法，但效果均不 能和低分子肝素相当。

1976年Johnson等发现当皮下注射从肝素钠分离出来的分子量较小的片 段(即低分子肝素，简称LMWH)时，在人体内其抗活性X因子(FXa)的 作用远高于普通肝素(SH)，而出现副作用却明显降低，其报道立即引起人们 广泛的兴趣与密切关注。80年代后低分子肝素以其抗血栓作用强、出血副作 用小，半衰期长、生物利用率高等优异的药用物性，成为了当今肝素研究的 热点。

肝素钠的纯化过程主要是对粗品肝素钠进行除杂和脱色，目前，国内肝 素钠的纯化主要是在不同pH条件下采用高锰酸钾和过氧化氢两步氧化法或 过氧化氢分次加入的二次氧化法，再以有机溶剂进行分级沉淀；但第一种工 艺的缺点是产品的活性损失大、色泽差、生产的二氧化锰较难滤除，且二氧 化锰对肝素钠有部分吸附作用，同时得到肝素外用级或类肝素等副产品，使 产品回收率较低；第二种方法所得产品色泽较好，目前应用比较广泛，但可 能是二次氧化对肝素钠结构造成破坏，难以得到较高纯度的低分子量肝素钠。

(三)发明内容：本发明的目的就在于针对现有技术的不足，提供一 种生产周期短、产品收率高、质量稳定的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化 方法。

本发明包括下述步骤：

第一步：未分级肝素钠溶液的制备

①提取

将肠粘膜加2-3倍水于反应罐中以蛋白酶酶解，蛋白酶的用量为肠粘膜重 量的5-8％，酶解温度50-55℃，pH8.0-9.5，酶解时间3-5小时，酶解完毕， 过滤，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量3-4倍的碱性阴离子交换树脂 搅拌吸附，第一次吸附6-10小时，滤出树脂后，再加入树脂搅拌吸附5-8 小时，过滤，合并两次树脂，弃去滤液；

②除杂

将所得树脂置于1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中搅拌40-45分钟，滤出 树脂；

③洗脱

将树脂置于洗脱罐中，以树脂体积2-3倍量的浓NaCl溶液进行梯度洗脱， 第一次以4.0-4.5mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱时间6小时，第二次第三次分 别用3.0-3.5mol/L的NaCl溶液洗涤3小时，合并三次洗脱液；

④过滤

调整洗脱液pH值至11-12，过滤，滤液再调pH至7.0-7.5，即可得未分 级的肝素钠溶液；

第二步：未分级肝素钠溶液的分离纯化

①肝素酶酶切降解

在所制得的未分级肝素钠溶液中按肝素酶∶肝素钠溶液＝1∶12.5(g/L)的比 例加入固相化的肝素酶，缓慢搅拌40-50分钟，高速离心分离除固相化肝素酶， 得酶切降解后的肝素钠溶液；

②第1次超滤

将所得肝素钠溶液用截留分子量15K的超滤膜超滤，得超滤液I；

③胰酶酶解

将超滤液I升温至50℃，加超滤液重量0.1-0.5％的胰酶，调pH值至6.5 -8.5，恒温酶解3小时，然后升温至90℃，冷却后过滤，得滤液；

④第2次超滤

将所得滤液，用截留分子量10K的超滤膜超滤，得超滤液II；

⑤第3次超滤

将超滤液II用截留分子量4K的超滤膜超滤，以超滤液1-2倍的纯水冲洗 2次，分别收集截留液和超滤液III，将截留液冷冻干燥，即得低分子肝素钠；