[发明专利]一种检测呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种检测呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及荧光定量PCR试剂盒的用途，适用于对血清制品中的呼肠孤病毒污染进行实时监控，同时广泛用于该病毒感染的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持。

背景技术

呼肠孤病毒属呼肠孤病毒科(Reoviridae)，具分节段的双链RNA基因组，无囊膜，有双层衣壳，其宿主范围广，能感染人、脊椎动物、昆虫、植物的5个属。在牛群中主要引起幼年动物腹泻、脱水而死亡，是奶牛和肉牛群的常发病。牛群中的抗体检出率极高，急性发作时，死亡率甚高，给畜牧业、国际贸易出口和食品安全等带来严重的问题。由于Reovirus的组织培养宿主范围相当广，常导致培养细胞污染来自血清的Reovirus，且常常不易引起注意，给细胞培养以及相关基础研究带来一定的问题。呼肠孤病毒的快速检测是控制和消灭该病的前提，但其常规检测方法有一些不足之处，检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类：

1.血清学诊断技术包括补体结合实验、中和实验、凝集实验、免疫扩散、沉淀实验、免疫电泳技术、免疫荧光染色、双抗体夹心ELISA和免疫电镜技术等。在这些方法中得到普遍承认且广泛应用的有：补体结合实验、间接血凝试验、琼脂扩散实验、中和实验。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，反应时间长，材料多，准备周期长，检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。

2.生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本高，周期长，浪费生物资源和人力物力。

3.分子生物学诊断技术包括核酸杂交实验、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、负染电镜检测等。核酸杂交、聚丙烯酰胺凝胶电泳等检测方法更适合于对病毒特性进行更加深入的研究，由于整个系统操作复杂，过程繁多，成本高，不适宜同时进行大批量检测，因而受到很大限制。相比之下，普通RT-PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。样品可以是器官、组织、细胞中的Reovirus，并可与不同的Reovirus株与轮状病毒、边界病毒相区别，这是免疫学方法无法替代的。但这种传统的定量方法测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA或RNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA或RNA拷贝数。因此，如何快速、准确测定呼肠孤病毒是面临的主要难题之一。