[发明专利]一株重组毕赤酵母菌株及其筛选方法

权利要求书

1.一株重组毕赤酵母菌株，其特征在于为一株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115-07ALDH2 CCTCC NO：M208266。

2.如权利要求1所述的一株重组毕赤酵母菌株的筛选方法，其特征在于：

一).质粒pPIC9K-ALDH2的获得及其验证

1).目的序列设计与合成：

由Genebank上人ALDH2 DNA的gene ID217序列，删除UTR和信号肽并加上内切酶 EcoR I和内切酶Not I酶切位点，再根据毕赤酵母密码子用法修改了28个碱基得到目的序列 ALDH2；具体序列如下：

CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT  60

TCTGCAACCAGATTTTCATAAACAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC  120

CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG  180

ATGTGGACAAGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC  240

GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG  300

ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT  360

ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAAATGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA  420

AGTACCACGGGAAAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC  480

CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGAATTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA  540

AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGAAACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC  600

CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG  660

TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG  720

TGGACAAAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG  780

GGAGCAGCAACCTCAAGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA  840

TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC  900

AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT  960

TTGTGGAGCGAAGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGAACCCCTTTGATAGCA  1020

AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGAAGATCCTCGGCTACATCA  1080

ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTAAGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG  1140

GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG  1200

AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGAAGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG  1260

GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACAAAGGATTTGGACA  1320

AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG  1380

TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG  1440

GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA  1500

AGAACTCAGCGGCCGA                                              1516

按上述目的序列ALDH2，用现有的重叠延伸法合成产人乙醛脱氢酶2序列，用现有的常 规方法将产人乙醛脱氢酶2连接在质粒pUC57上，得到质粒pUC57-ALDH2；使用上海生工 的高效制备感受态细胞试剂盒制备大肠杆菌DH5α感受态细胞；将10μL质粒pUC57-ALDH2 与50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰上放置30min，然后在42℃热击1-2min；再放 置在冰上冷却1-2min后加入500μL的LB培养基，37℃振荡培养1h；取100μL培养物涂布 到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜，得到的含有质粒pUC57-ALDH2 的阳性转化子，保存备用；

2).质粒构建：

a.酶切

用酚氯仿或DNA提取试剂盒从含有质粒pUC57-ALDH2的阳性转化子中提取质粒 pUC57-ALDH2；准备质粒pPIC9K，并用内切酶EcoR I和内切酶Not I双酶切；

①按下述原料配比：

质粒pUC57-ALDH2                    10μL，

缓冲液Wash Solution                3μL，

内切酶EcoR I、浓度为20U/μL        1μL，

内切酶Not I、浓度为5U/μL          3μL，

小牛血清白蛋白BSA、浓度为1mg/mL    3μL，

蒸馏水                             10μL，

选取质粒pUC57-ALDH2、Wash Solution、内切酶EcoR I、内切酶Not I、小牛血清白 蛋白和蒸馏水，在37℃酶切12h；电泳并用酚氯仿法或DNA提取试剂盒回收产人乙醛脱氢 酶2序列；

②按下述原料配比：

质粒pPIC9K                        10μL，

缓冲液Wash Solution               3μL，

内切酶EcoR I、浓度为20U/μL       1μL，

内切酶Not I、浓度为5U/μL         3μL，

小牛血清白蛋白BSA、浓度为1mg/mL   3μL，

蒸馏水                            10μL，

选取质粒pPIC9K、缓冲液Wash Solution、内切酶EcoR I、内切酶Not I、小牛血清白 蛋白和蒸馏水，在37℃酶切12h；电泳并用酚氯仿法或DNA提取试剂盒回收酶切后的质粒 pPIC9K；

b.连接

按产人乙醛脱氢酶2序列和酶切后的质粒pPIC9K的摩尔比2∶1混合，得到混合DNA， 用T4连接酶连接；

按下述原料配比：

T4连接酶          1μL，

T4连接酶缓冲液    2μL，

混合DNA           7μL，

选取T4连接酶、T4连接酶缓冲液和混合DNA，在4℃连接过夜，得到连接产物 pPIC9K-ALDH2；

连接产物pPIC9K-ALDH2转化大肠杆菌DH5α：将10μL上述连接产物pPIC9K-ALDH2 与50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰上放置30min，然后在42℃热击1-2min；再放 置在冰上冷却1-2min后加入500μL的LB培养基，37℃振荡培养1h；取100μL培养物涂布 到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜，得到大肠杆菌DH5α pPIC9K-ALDH2；

二)、菌株的构建和筛选：

1).质粒的线性化与电转导：

质粒的线性化：从大肠杆菌DH5αpPIC9K-ALDH2中提取质粒pPIC9K-ALDH2；采用内 切酶Sac I 5μL、小牛血清白蛋白3μL、缓冲液10×BufferG 3μL、超纯水9μL和10μL质粒 pPIC9K-ALDH2，其中，内切酶Sac I的浓度为2U/μL，小牛血清白蛋白的浓度为1mg/mL， 在37℃孵育过夜；再用酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，抽提线性化产物，然后用乙醇沉淀线 性化产物，最后用10-20μLTE缓冲液溶解，得到线性化质粒溶液；

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115的电转导：首先取0.2mL巴斯德毕赤酵母(Pichia  pastoris)GS115的一级种子液，接种到含50ml YPD培养基的300mL摇瓶中，使巴斯德毕 赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌体浓度生长至OD600＝1.3-1.5，后收集菌体，用5.0mL 灭菌超纯水洗涤菌体5次，最后用0.1mL、4℃的1M山梨醇来悬浮细胞；然后取90μL山梨 醇悬浮细胞与10μL线性化质粒溶液混合，转入4℃的1mm电转杯中，在电转仪1200V、5ms 的条件进行电转，电转导样品涂布到MD培养基上，30℃培养2-3d，得到巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株；

2).菌株的筛选：

从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株中挑选单菌落，进行诱导表 达，首先采用SDS-PAGE电泳来剔除假阳性菌株；然后，再对阳性菌株进行再一次的诱导表 达，检测方法改变为检测其上清液中的酶活，选取酶活最高的菌株的最佳菌株，即得到一株 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2菌株。