[发明专利]靶向性溶肿瘤腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法及应用

权利要求书

1.一种肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法，其特征是：该病毒载体为C亚类的5型腺病毒Ad5，删除该腺病毒的E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个内在基因，保留E3B基因，同时，保留E3gp-19K启动子表达外源治疗基因，所述载体可插入任意一种有助于治疗肿瘤或用于感染性疾病疫苗的抗原基因。

2.根据权利要求1所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法，其特征是：该方法包括以下步骤，

(1)首先用PCR方法得到要改造序列E1A-CR2两侧的基因片段，上游序列称为左臂，下游序列称为右臂，用基因工程方法把左臂和右臂按病毒基因一致的顺序连接到质粒载体pSuperShuttle上，建成E1A-CR2穿梭载体；

将所述腺病毒载体Ad5和E1A-CR2穿梭载体按1∶2～10的比例转化到BJ5183细菌中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，转染到293细胞中，得到E1A-CR2缺失的Ad5R-CR2病毒载体；

(2)用与所述构建E1A-CR2穿梭载体相同的方法构建E1B19K穿梭载体，然后与Ad5R-CR2病毒载体同源重组，得到CR2和E1B19K双缺失的Ad5R-CR2R-E1B19K病毒载体；

(3)用PCR方法扩增E3gp-19K基因蛋白编码区两侧序列，左臂范围从-1087bp到0bp，其中包含E3gp-19K基因的启动子，右臂起始于E3gp-19K基因的终止密码向后1146bp，两臂用酶切位点相连，构建穿梭载体，然后与Ad5R-CR2R-E1B19K病毒载体同源重组，得到E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个编码基因均缺失的腺病毒载体pZZU001，将pZZU001转染到293细胞中，生产所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene。

3.根据权利要求1或2所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法，其特征是：所述肿瘤为各种实体瘤；所述感染性疾病为艾滋病、幽门螺旋杆菌、血吸虫、霍乱或肝炎。

4.一种按照权利要求1或2所述方法构建的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21，其特征是：所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene携带人的免疫趋化因子CCL21基因。

5.根据权利要求4所述肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21的构建方法，其特征是：该方法包括如下步骤：

(1)用NcoI和NheI双酶切pORF5-hExodus-2质粒，然后用T4DNA聚合酶将切出的hCCL21基因片段补平，备用；

(2)酶切腺病毒载体pZZU001，然后将所述的hCCL21基因平端插入到病毒载体的酶切位点上，用PCR方法鉴定筛选插入方向正确的重组载体，然后转染到293细胞中，生产所述病毒载体Ad-TD-hCCL21。

6.权利要求4所述的肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hCCL21在用于制备治疗肿瘤的药物中的应用。