[发明专利]靶向性溶肿瘤腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法及应用

说明书

一、技术领域：

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，特别是涉及一种肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法及应用。

二、背景技术：

恶性肿瘤是目前威胁人类健康的严重疾病，尤其是中晚期恶性肿瘤。化疗和放疗是目前临床上治疗中晚期肿瘤的常用方法。尽管标准的化疗和放疗已在临床上应用了几十年，然而大多数临床中晚期病人的整体生存率仍无明显改善。因此，在理论上和临床实践上不仅需要创新性的肿瘤治疗方法，而且要对肿瘤细胞有更好的选择性和更明确的作用机制，同时又不会与现在常用的治疗药物产生拮抗。

病毒可以通过多种机制感染人类细胞，并在细胞中复制，最终杀伤被感染的细胞。一个世纪以前，当病毒被发现时，临床医生就试图用野生型病毒治疗肿瘤，但是由于病毒治疗的毒性副作用和当时化疗药物的兴起就一度被禁用。随着DNA重组技术的发现和对肿瘤发生分子机制的深入了解，用基因工程方法来改造病毒，使其安全地靶向杀伤肿瘤细胞已成为现实。复制选择性溶肿瘤病毒是一种新的肿瘤治疗方法。所谓复制选择性溶肿瘤病毒，是根据分子病毒学、肿瘤分子生物学和分子生物学等知识，用基因工程方法改造野生型病毒或发现先天性嗜肿瘤的病毒株，这些病毒能选择性的在肿瘤细胞中复制，可杀伤肿瘤细胞并释放新的病毒感染邻近肿瘤细胞；而在正常细胞中不复制或复制很低。复制选择性溶肿瘤病毒不仅本身可以杀伤肿瘤细胞，而且还可以携带治疗基因，使治疗基因通过复制达到高水平、长时间的表达，并且还能广泛地感染大量肿瘤细胞，克服非复制型载体的不足；同时可以使肿瘤细胞对常规化疗及放疗效果增强，并通过多种途经来产生抗肿瘤效果，如调节免疫反应、抑制新生血管生成等。因此，复制选择性溶肿瘤病毒目前已成为肿瘤治疗中的热点。

自从二十多年前Martuza等首次用改造的复制选择性溶肿瘤病毒(HSV)治疗肿瘤以来，用病毒治疗肿瘤又获得新生。目前已有多种微生物被发现或修饰用于肿瘤治疗，如疱疹病毒、腺病毒、痘苗病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒等。

鉴于腺病毒毒性低，基因结构清楚，能以非整合方式感染分裂和非分裂细胞，理化性质稳定，又适合符合GMP标准的高滴度生产与纯化，故复制选择性溶肿瘤腺病毒(Replication-selective oncolytic Adenovirus，RSOA)目前已成为肿瘤病毒治疗中研究最为广泛的病毒。第一代RSOA-Onyx-015(或dl1520)，在中国称H101，已被国家医药管理局正式批准为用于头颈部的肿瘤治疗药物。临床试验表明，这种病毒虽然显示了好的肿瘤选择性和安全性，但单纯应用时，对肿瘤的治疗效果甚微。

第一代具有复制能力的溶肿瘤腺病毒H101，是E1B-55K和大部分E3区基因删除的腺病毒。E1B-55K蛋白抑制肿瘤抑制蛋白p53，阻止p53介导的感染细胞的凋亡。P53功能的缺失是大多数肿瘤的共同特征，因此，E1B-55K基因的删除能够阻止病毒在表达有功能的p53的正常细胞内复制，但是允许在缺乏有功能的p53的肿瘤细胞内复制。这种病毒是第一次被改造的复制选择性腺病毒，并进入了头颈部和胰腺等癌症的临床研究。但是E1B-55K蛋白是病毒mRNA从细胞核输出必需的蛋白，因此E1B-55K缺失的腺病毒H101杀伤肿瘤细胞的能力就相对减弱。基于对腺病毒生命周期中基因产物作用的更加彻底的了解，第二代溶肿瘤腺病毒，即腺病毒E1A蛋白与肿瘤抑制蛋白Rb相结合的CR2基因被删除的RSOA-dl922/47，显示出更好的抗肿瘤能力，在相同体内外模型中比dl1520(H101)的效果更好。但该病毒在具有增值能力的正常细胞中仍有一定的复制能力。为了进一步提高该病毒的选择性，我们对腺病毒E1B19K基因对RSOA的影响进行了研究，结果发现删除E1B19K可增强腺病毒对肿瘤细胞的杀伤能力和选择性，并能加快腺病毒粒子的释放。此外，H101和dl922/47都缺乏大部分腺病毒的E3区基因。先前认为腺病毒E3区域基因对腺病毒在体外的复制没有影响，删除该区域能增加装载外源基因的能力，但是最近我们发现，腺病毒E3B区域严重影响溶肿瘤腺病毒的抗肿瘤效果，删除该区域基因明显加快机体对腺病毒的清除，但是删除E3区的E3gp-19K导致病毒的抗肿瘤效果增强。

为了增强腺病毒对肿瘤细胞的特异性和高效性，降低对正常细胞的毒性，必须根据最新的研究成果对腺病毒进行改造。