[发明专利]快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒

权利要求书

1、一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：

由DNA提取液，荧光定量PCR反应液，标准阳性模板pMD-B1、弓形虫B1基因特异性引物、阴性质控标准品组成。

正向引物Toxo-BF：5′-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3′；

反向引物Toxo-BR：5′-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3′；

标准阳性模板pMD-B1含有弓形虫保守基因的223个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是：

荧光定量PCR反应液由SYBR-Green I，正、反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl₂、dNTPs及无菌双蒸水组成。

3、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是弓形虫标准阳性模板所包含的B1基因的核苷酸序列为：

5′-tccttcgtccgtcgtaatatcaggccttctgttctgttcgctgtctgtctagggcacccttactgcaagagaagtatttgaggtcatatcgtcccatgaagtcgaccacctgtttcctctcttcactgtcacgtacgacatcgcattcaagggaagagatccagcagatctcgttcgtgtattcgagacaagagaggtccgcccccacaagacggctgaagaa-3′。

4、权利要求1所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)DNA提取液：配制裂解缓冲液，包括如下组分：0.1M Tris-HCl(pH 8.0)，0.1～0.15M NaCl，0.1～0.5M EDTA(pH 8.0)和1％～4％SDS。配制蛋白酶K的贮存液，浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体，终浓度为4μg/μl，即为DNA提取液。

2)定量PCR反应液包括：由SYBR-Green I，正反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl₂、dNTPs及无菌双蒸水组成；

3)标准阳性模板pMD-B1：标准阳性模板pMD-B1含有弓形虫高度保守基因B1基因223个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，用分光光度计测A₂₆₀定量并稀释至10¹⁰拷贝/μl，使用前进行10倍梯度的系列稀释；

4)弓形虫B1基因特异性引物：

正向引物Toxo-BF：5′-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3′；

反向引物Toxo-BR：5′-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3′；

5)阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水。