[发明专利]快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于人兽共患传染病病原体的检测技术领域，尤其涉及一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，适用于弓形虫定性定量检测。

背景技术

弓形虫是一种广泛寄生于人和动物有核细胞中的寄生性原虫，猫科动物为其终末宿主，人和许多脊椎动物为其中间宿主。该虫呈世界性分布，人和许多动物均能感染，引起人兽共患的弓形虫病。由于其对人类健康及农牧业生产存在很大的潜在危害，快速、准确地诊断弓形虫病显得十分重要。

临床检测上，传统的病原学检查方法具有检出率不高、培养时间长等不足，传统的血清学方法由于简便、快速、敏感性尚佳，仍然是各实验室的常用方法，但血清学只是感染的间接标志，当机体免疫力低下时，则很难获得可供诊断的血清学结果。由于人群感染弓形虫的普遍性，血清学检测对现症感染的诊断价值受到一定限制。常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使其在临床诊断上受到一些限制，因此急需一种精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。

发明内容

本发明提供一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，其目的在于克服现有技术存在检出率不高、培养时间长等缺点和不足，用于弓形虫的快速检测。

本发明提供的快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，包括DNA提取液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板弓形虫pMD-B1、弓形虫B1基因特异性引物、阴性质控标准品等组成；其中，

标准阳性模板pMD-B1含有弓形虫高度保守B1基因的223个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖；

荧光定量PCR反应液由SYBR-Green I，正反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl₂、dNTPs及无菌双蒸水组成；

弓形虫标准阳性模板所包含的B1基因的核苷酸序列为：

5′-tccttcgtccgtcgtaatatcaggccttctgttctgttcgctgtctgtctagggcacccttactgcaagagaagtatttgaggtcatatcgtcccatgaagtcgaccacctgtttcctctcttcactgtcacgtacgacatcgcattcaagggaagagatccagcagatctcgttcgtgtattcgagacaagagaggtccgcccccacaagacggctgaagaa-3′。

本发明所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1、DNA提取液：配制裂解缓冲液，包括如下组分：0.1M Tris-HCl(pH8.0)，0.1～0.15M NaCl，0.1～0.5M EDTA(pH8.0)和1％～4％SDS。配制蛋白酶K的贮存液，浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体，终浓度为4μg/μl，即为DNA提取液。

2、定量PCR反应液包括SYBR-Green I，正反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl₂、dNTPs及无菌双蒸水组成。

3、标准阳性模板弓形虫pMD-B1：标准阳性模板pMD-B1是含有弓形虫高度保守基因B1基因223个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，用分光光度计测A₂₆₀定量并稀释至10¹⁰拷贝/μl，使用前进行10倍梯度的系列稀释。

4、弓形虫B1基因特异性引物：正向引物Toxo-BF：5′-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3′；反向引物Toxo-BR：5′-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3′。

5、阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水。

本试剂盒的工作原理