[发明专利]一种新的载脂蛋白A-Ⅱ的制备

说明书

发明领域

本发明涉及重组蛋白质及其制备，特别是涉及在巴斯德酵母中表达重组人载脂蛋白A-II(rhApoA-II)，以及优化的高密度发酵生产重组人载脂蛋白A-II的方法。

发明背景

载脂蛋白A-II(apolipoprotein A-II，ApoA-II)由肝脏和小肠合成，人血浆中的ApoA-II半衰期为4.4天，是血清高密度脂蛋白(HDL)中第二种主要的载脂蛋白，约占HDL中蛋白总量的20％。在乳靡微粒(CM)中它的含量可达总载脂蛋白的7％～10％，极低密度脂蛋白(VLDL)中也有少量的ApoA-II存在，血浆中ApoA-II的浓度为0.35～0.5g/L(罗静聪，刘秉文，蓝天鹤.人血浆载脂蛋白A-II的分离纯化及鉴定[J].生物化学杂志，1990，6(2)：157-161)。

ApoA-II是由两条各含77个氨基酸的肽链组成，单体分子量为8700D，在人血浆中以二聚体形式存在，在不加还原剂的SDS-PAGE中测出相对分子质量约为17.5kD。ApoA-II有多态性存在，最主要的多态性等电点为4.9。人ApoA-II mRNA长473个碱基，含有一个58bp的5’不翻译区。人类和鼠的ApoA-II定位于1号染色体上。其基因结构与ApoA-I、A-IV、C-II、C-III及E的基因结构颇为相似，含有4个外显子和3个内含子。内含子I长169bp，插入基因组5’不翻译区；内含子II长293bp，插入紧邻信号肽基因酶切位点的密码区；内含子III插入成熟肽的编码区。

ApoA-II具有多种生理功能：①维持HDL结构：ApoA-II肽段12～31和肽段50～77具有与磷脂的结合能力，经二级结构分析认为，残基17～30和51～62形成的双性螺旋结构是人ApoA-II与脂质结合的分子基础；②激活肝脂酶(hepatic lipase，HL)，用以水解CM和VLDL中的三酰甘油和磷脂；③抑制凝血酶原活性；④抑制卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)活性，从而阻碍细胞内胆固醇的运出，酯化和转移；⑤其他：ApoA-II还具有置换HDL颗粒中的ApoA-I，识别HDL受体、结合脂蛋白和部分拮抗低密度脂蛋白对内皮细胞的损伤作用，从而保持内皮细胞膜的完整性等功能。

ApoA-II的多种生物学活性使其在脂质代谢调控中起着十分重要的作用。现阶段，对ApoA-II的检测多限于试验研究，对某些疾病的诊断或研究起到辅助作用。目前，ApoA-II多是从血浆中分离并纯化得到的，成本高而产量低。因此，有必要建立和发展重组表达和纯化ApoA-II的方法，以便满足实验室研究的需求。

甲基营养酵母，特别是巴斯德毕赤酵母是已被深入研究的真核表达系统，并已被用于表达许多有用的蛋白质。例如，美国专利5,324,639公开了在甲基营养酵母特别是巴斯德毕赤酵母细胞中生产胰岛素样生长因子1的方法；美国专利5,330,901公开了使用巴斯德毕赤酵母系统表达人血清白蛋白的方法；美国专利5,965,389提供了在甲基营养酵母中表达L-谷氨酸脱羧酶(GAD65)的DNA构建体以及由之制备纯的GAD65的方法；美国专利公开了在巴斯德毕赤酵母中表达血小板衍生的细胞因子(PDGF)的方法；美国专利6,780,615描述了使用重组巴斯德毕赤酵母生产应乐果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未见关于使用巴斯德毕赤酵母生产人载脂蛋白A-II的报道。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种使用甲基营养酵母生产重组人载脂蛋白A-II(rhApoA-II)多肽的方法，该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作连接的元件的DNA构建体转化的：(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码载脂蛋白A-II的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而以至少50mg/L培养基的浓度产生载脂蛋白A-II多肽。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

本发明的另一个目的是提供用于表达重组人载脂蛋白A-II的甲基营养酵母，该酵母能够依靠作为碳源和能源的甲醇生长，并且是被包括甲基可诱导的转录启动子、编码载脂蛋白A-II的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。