[发明专利]ACY W135群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗

权利要求书

1、一种ACY W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，每支成品含以下组分及含量：

A群脑膜炎球菌多糖疫苗：        50μg

C群脑膜炎球菌多糖疫苗：        50μg

Y群脑膜炎球菌多糖疫苗：        50μg

W135群脑膜炎球菌多糖疫苗：     50μg

b型流感嗜血杆菌结合疫苗：      10μg

乳糖：                         2.5～3.0mg。

2、权利要求1所述联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤：

1)菌种的的选用：选用ACYW135群脑膜炎奈瑟氏球菌，b型流感嗜血杆菌菌种，用于冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备；

2)生产用种子

启开工作种子批菌种，经传代检定合格后，接种于综合培养基或其他适宜培养基，制备生产用种子；

3)生产用培养基

采用综合培养基或经批准的其他适宜培养基，培养基不应含有与十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分；

4)培养

采用培养罐液体培养；在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃；

5)收获和杀菌

于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养；取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌；以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜；

6)去核酸

将已杀菌的培养液离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2-8℃静置1-3小时或过夜，离心收集澄清的上清液；

7)沉淀多糖

于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在-20℃以下，待纯化；

8)多糖纯化

将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液；提取过程应在15℃以下进行；

9)内毒素去除

取A、C、W₁₃₅、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量；

10)半成品配制及分装

将检定合格的ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖原液，b型流感嗜血杆菌结合疫苗与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检；

11)冻干

将ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为：-35℃预冻2小时，制品-40℃冷冻4～5小时，逐渐升温真空干燥10～12小时，30℃以下恒温真空干燥5～6小时，全过程累计20～24小时，制备出冻干ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗成品。