[发明专利]一种猪血凝性脑脊髓炎病毒胶体金抗原检测试纸条及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种由血凝性脑脊髓炎病毒引起疾病的检测方法，尤其是提供了一种猪血凝性脑脊髓炎病毒胶体金抗原检测试纸条，同时还公开了其制备方法，属于疾病检测技术领域。

背景技术：

猪血凝性脑脊髓炎是由血凝性脑脊髓炎病毒(简称：HEV)引起仔猪的一种急性、高度接触性传染病。HEV主要侵害1-3周龄的仔猪，临床上以仔猪呕吐、衰竭和明显的神经症状为主要特征，死亡率高达20-100％。由于该病的发生呈世界范围内分布，所以其对养猪业的威胁或潜在影响较大。目前，常规的HEV检测技术主要有病毒分离鉴定、RT-PCR、中和试验、补体结合试验、琼脂扩散试验等，上述方法在检测HEV起到一定的作用，然而用于临床上快速、准确地诊断该病时都存在着不同程度的缺陷，这些诊断方法和检疫规程研究的滞后已影响到对该病流行时的快速检测。

发明内容：

本发明公开一种猪血凝性脑脊髓炎病毒检测试纸条，用于诊断猪血凝性脑脊髓炎，解决了常规的HEV检测方法速度慢、准确性差等缺欠。

本发明还提供了HEV检测试纸条的制备方法，适用于工业化生产。

本发明提供的HEV检测试纸条，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的HEV单克隆抗体胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化兔抗HEV抗体，质控线包被有正常抗小鼠IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫。

本发明HEV检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

本发明根据抗原抗体能特异结合的免疫学基本原理，将纯化HEV单克隆抗体用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜上制备成金标垫，将纯化的兔HEV抗体和正常抗小鼠IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上的检测线处和质控线处，当被检样品中含有HEV抗原时，则于金标垫与胶体金标记的HEV单克隆抗体抗体结合，并在吸收垫的作用下，向前渗透泳动，与检测线上的HEV单克隆抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。

本发明试纸条的使用方法如下：取病死猪脑组织乳化物约0.5ml加入小试管中，然后插入试纸条，待3-5分钟反应带清晰后观察结果(见图2)。出现1条红色(对照)沉淀线，为HEV诊断阴性；出现2条红色(样品和对照)沉淀线，为HEV诊断阳性，未出现沉淀线则为无效。

本发明的积极效果在于：首次将单克隆抗体与胶体金免疫层析技术结合，制备HEV胶体金检测试纸条，并拟应用于临床，提高HEV的防治能力，可以快速，灵敏检测HEV，避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，结果易于观察判断，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要。并且检测结果可以长期保存，便于对照分析。可用于肉眼水平的免疫检测，样本用量极小，对操作者无毒性，对环境无污染等。因此应用胶体金技术研制HEV抗原检测试纸条具有重大的社会意义和广阔的市场前景。

附图说明

图1.HEV检测装置示意图；

1.样品垫；2.金标垫；3.硝酸纤维素膜；4.吸收垫；5.检测线；6.质控线。

图2.HEV试纸条检测结果判定。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

猪血凝性脑脊髓炎病毒抗原制备

将猪血凝性脑脊髓炎病毒接种PK-15细胞，细胞病变(CPE)达80％以上，收获病毒，反复冻融3次后，3000r/min离心30min，除去细胞碎片；再经5000r/min，离心30min，取上清以24000r/min离心3h，将沉淀用少量PBS充分悬浮，即得粗提病毒。将病毒粗制剂进行25％、35％、45％、55％不连续蔗糖密度梯度离心，20000r/min离心2h，收集病毒带，然后加适量PBS缓冲液再次超速离心除去蔗糖，最后用PBS缓冲液稀释沉淀物，即得纯化病毒。

实施例2

猪血凝性脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与纯化