[发明专利]一种两亲性高分子阳离子聚合物的应用

权利要求书

1.一种两亲性高分子阳离子聚合物的应用，其特征在于，所述的两亲性高分子阳离子聚合物用作siRNA转染载体；

所述的两亲性高分子阳离子聚合物是分子量为25000的超支化聚乙烯亚胺与聚谷氨酸苄酯的共聚物：超支化聚乙烯亚胺-聚谷氨酸苄酯；所述的超支化聚乙烯亚胺与聚谷氨酸苄酯的质量比为6∶4；所述的两亲性高分子阳离子聚合物的尺寸为150-250nm；所述的siRNA为沉默荧光素酶的Luc siRNA，其序列为5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′。

2.如权利要求1所述的一种两亲性高分子阳离子聚合物的应用，其特征在于，所述的两亲性高分子阳离子聚合物用作siRNA转染载体的用法的步骤和条件如下：

(1)用常规方法合成siRNA；

(2)两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒的制备

取所述的两亲性高分子阳离子聚合物加水溶解至浓度为1mg/mL，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌；用无菌蒸馏水配制浓度为0.1mg/mL的siRNA水溶液，按照所述的两亲性高分子阳离子聚合物：siRNA的质量比为1.25∶1～40∶1，将所述的两亲性高分子阳离子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上述溶质质量比混合，把该混合水溶液置室温放置20分钟，进一步促进两亲性高分子阳离子聚合物与siRNA复合物颗粒的形成，得到一种含两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合物颗粒；

(3)一种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体

①细胞的培养

复苏细胞，在含有体积分数为10％的小牛血清的DMEM细胞培养液中并在含体积百分数为5％的CO₂、温度为37℃的孵箱中连续培养；

②体外转染

转染前24小时内，将细胞按1×10⁴个细胞/孔种于96孔细胞培养板中，置于含体积百分数为5％的CO₂、温度为37℃的孵箱中连续培养至80～90％融合；转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒，以及含有体积百分数为10％FBS的高糖DMEM培养液，继续培养24小时，加入复合颗粒6h换液作为对照实验；

③体外转染效率的测定

取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入50μL细胞裂解液裂解，吹打均匀后取出20μL至1.5mL离心管中，然后加入100μL荧光素底物，用光度计测定转染效率；

再取出20μL裂解液至新96孔板，选用美国Pierce公司BCA蛋白检测试剂盒，加入200μL检测液，37℃孵育30分钟后，酶标仪562nm波长检测。