[发明专利]一种两亲性高分子阳离子聚合物的应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体及用法。

背景技术

RNA干扰现象是利用siRNA靶向实现转录后水平基因沉默的现象，RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。siRNA基因沉默技术是治疗各种基因相关疾病的最有效方法^[1-6]。

研究表明，人工合成的具有21～22个核苷酸序列的siRNA没有细胞毒性，并且能够有效的实现RNA干扰并达到基因治疗的目的^【7-9】。尽管如此，由于siRNA本身不能进入靶向进入病变组织的功能，在临床应用方面受到了极大的制约^【10-12】。近年来，非病毒类阳离子基因载体已经应用在了siRNA传递体系中，如PEG-PLL和PEG-PEI^【13-14】。

PEI类载体已经被证明了在质粒转染体系中具有很好的效果，并在siRNA转染方面也起到一定的作用，但是聚阳离子带有的大量的正电荷，当剂量增大时会与细胞表面有强烈的作用而导致细胞死亡，因此，在PEI表面进行修饰遮蔽一部分正电荷能够有效的降低细胞毒性^【15-18】。

发明内容

本发明的目的是寻找低毒性，转染效率高，靶向性和pH敏感性强的非病毒类基因载体。

本发明选用超支化聚乙烯亚胺改性的超支化聚乙烯亚胺(PEI)-聚谷氨酸苄酯(PBLG)的共聚物PEI-PBLG，选取PEI-25k和Lipofectamine2000作为对照，介导荧光素酶siRNA进行基因沉默。我们发现PEI-PBLG相对PEI-25k能够有效提高siRNA沉默效率，并降低了细胞毒性。

本发明提供了一种两亲性高分子阳离子聚合物的应用，其特征在于，所述的一种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体；

所述的两亲性高分子阳离子聚合物是分子量为25000的超支化聚乙烯亚胺(PEI)与聚谷氨酸苄酯(PBLG)的共聚物PEI-PBLG，其中，所述的超支化聚乙烯亚胺与聚谷氨酸苄酯的质量比为6∶4；所述的两亲性高分子阳离子聚合物的尺寸为150-250nm；

所述的siRNA为沉默荧光素酶的Luc siRNA，其序列为5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′。对照物为Rev siRNA，其序列为5′-AGCUUCAUGAGUCGCAUUCdTdT-3′。

所述的一种两亲性高分子阳离子聚合物的制法：用参考文献[19]提供的方法制备。

本发明提供的一种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体的用法，步骤和条件如下：

(1)用常规方法合成siRNA；

(2)两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒的制备

取所述的两亲性高分子阳离子聚合物加水溶解至浓度为1mg/mL，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌；用无菌蒸馏水配制浓度为0.1mg/mL的siRNA水溶液，按照所述的两亲性高分子阳离子聚合物：siRNA的质量比为1.25∶1～40∶1，将所述的两亲性高分子阳离子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上述溶质质量比混合，把该混合水溶液置室温放置20分钟，进一步促进两亲性高分子阳离子聚合物与siRNA复合物颗粒的形成，得到一种含两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合物颗粒；

(3)一种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体

(1)细胞的培养

复苏细胞，在含有体积分数为10％的小牛血清的DMEM细胞培养液中并在含体积百分数为5％的CO₂、温度为37℃的孵箱中连续培养；

(2)体外转染

转染前24小时内，将细胞按1×10⁴个细胞/孔种于96孔细胞培养板中，置于含体积百分数为5％的CO₂、温度为37℃的孵箱中连续培养至80～90％融合；转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒，以及含有体积百分数为10％FBS的高糖DMEM培养液，继续培养24小时，加入复合颗粒6h换液作为对照实验。

(3)体外转染效率的测定

取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入50μL细胞裂解液裂解，吹打均匀后取出20μL至1.5mL离心管中，然后加入100μL荧光素底物，用光度计测定转染效率；