[发明专利]15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制 备方法。

背景技术

孕二烯酮是迄今为止孕激素活性最强的甾体激素类药物，是新一代避孕药的主 要成分之一，具有重要的医用价值。因其孕激素活性高、无副作用、吸收快、无残 留、避孕效果可靠及良好的抑肿瘤作用，成为目前最为理想的口服避孕药的首选成 分。

15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成孕二烯酮的关键中间体，工业上主要采用化 学方法合成15α-羟基左旋乙基甾烯双酮，该类方法步骤繁琐，成本较高，不适于药 物的推广使用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用雷斯青霉催化甾体化合 物左旋乙基甾烯双酮生成15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，该方法具 有目标产物转化率高、纯化过程简单的优点。

本发明实现目的的技术方案是：

一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，步骤是：

(1)菌悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)菌种接种于斜 面培养基，5天后，用无菌生理盐水制备出菌悬液；

(2)一级种子培养：将菌悬液接入种子培养基培养，接种量10⁶-10⁹个/mL，培养 温度为25-30℃，转速80-120r/s，培养时间24-96h，得到种子培养液；

(3)二级发酵培养：将种子培养液以2-5％的接种量接入发酵罐继续培养，发酵控 制条件为温度25-30℃，转速160-240r/min，通气量为2L/min，菌体培养时间为 36-72h，得到发酵液；

(4)底物诱导：在已培养好的发酵液内加入0.1-0.3g/L的左旋乙基甾烯双酮诱导 16-48h小时；

(5)左旋乙基甾烯双酮转化：加入底物进行微生物转化，采用将左旋乙基甾烯双 酮底物用促溶剂溶解后加入发酵液的转化方式，转化条件为转速180-240r/min，转 化温度为25-30℃，转化时间90-150h；

(6)萃取制备成品：料液经过滤，所得滤饼经萃取处理，即得15α羟基化左旋乙 基甾烯双酮。

而且，所述促溶剂包括甲醇、乙醇、丙二醇、甘油、1，3-丁二醇、聚乙二醇、 苯甲醇二甲亚砜、二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基乙酰胺、乳酸乙酯、油酸乙酯，促 溶剂浓度1-6％。

而且，所述步骤(5)中滤饼的萃取方法是将滤饼烘干后，以与原发酵液1∶10-1∶ 20的体积比采用萃取剂萃取。

而且，所述萃取剂是乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、正己烷。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明方法是在雷斯青霉的发酵液中，利用雷斯青霉菌体Penicillium raistrickii(ATCC 10490)中所含的羟化酶，催化左旋乙基甾烯双酮的15α位发生羟基化 反应，生成15α-羟基左旋乙基甾烯双酮，通过优化发酵条件及转化工艺，有效提高 转化率。

2、本发明采用的微生物转化方法具有很高的立体选择性、区域选择性和化学选 择性，提高了底物转化率，在3‰投料量情况下，其转化率最高可达90％以上，简 化了目标产物制备与纯化的过程，避免大量有机溶剂的使用，既符合环保要求，又 降低生产成本。

3、本发明15α羟基左旋乙基甾烯双酮制备过程中无需加入昂贵的金属催化剂， 降低了生产成本；本方法各步骤反应条件温和，转化装置简单，适合工业化生产。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：

一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，本实施例采用促溶剂1％ 二甲基甲酰胺的15α羟化反应，步骤是：

(1)菌悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)菌种接种于斜 面培养基，5天后，用无菌生理盐水制备出菌悬液；

(2)一级种子培养：将菌悬液接入种子培养基培养，接种量10⁶/mL，培养温度为 28℃，转速120r/m，培养时间24h，得到适合接种的种子培养液；