[发明专利]定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法及其应用

说明书

【技术领域】

本发明属于医学超微量检测技术领域，是以多孔板做载体制备固相抗原酶标板，用于定量检测人血清TRAb(以TSAb为主)的板式荧光酶免方法(FEIA)及其应用。

【背景技术】

Graves’病(GD)是一种多发的自身免疫性甲状腺病(AITD)，促甲状腺素受体(TSHR)是GD发病中最主要的自身抗原。TSHR是存在甲状腺滤泡上皮细胞(TEC)膜上的一种糖蛋白，它与促甲状腺素(TSH)结合后，调节TEC的生长、分化及其合成和释放甲状腺激素的功能。在环境和遗传因素基础上，机体免疫功能异常变化导致AITD，TSHR是AITD的主要自身抗原之一，刺激机体产生促甲状腺素受体抗体(TRAb)，该自身抗体属于异质性抗体，包括甲状腺刺激性抗体(TSAb)和甲状腺阻断性抗体(TSBAb)，前者模拟TSH功能，长期持续地刺激甲状腺激素合成释放而导致GD，表现功能亢进；后者与TSHR特异位点结合而阻止TSH与TSHR的结合及其生理作用的发挥，表现为甲状腺功能低下。目前，TSAb对GD的致病作用已基本肯定，大量研究表明，TSAb的抗原表位主要分布于TSHR膜外区氨基端。TRAb是GD的主要病因，在GD的发病、发展和转归中起重要作用。检测人血清中以TSAb为主的TRAb是GD病因诊断、疗效观察和确定停药时机的重要指标。

目前，没有比较满意的国产TRAb检测技术。国外引进的相关技术有2种，(1)放射受体法(2)酶免法，其阳性检出率均不够理想，不能区分TSAb和TSBAb，而价格十分昂贵，且至今在国内未能推广。国外还有一种生物学分析法能区分TSAb与TSBAb，但方法烦琐，流程长且价格昂贵，只能用于科研，不宜常规使用。近年又有关于发光生物学分析法的报道，可用于检测TSAb和TSBAb。其特点是利用分子生物学技术建立TSHR基因与荧光素酶报告基因共转染且能稳定表达的CHO细胞系，借光产量的测定检测TSAb活性。该方法可以区分TSAb和TSBAb，但目前也是初步研究，技术尚未成熟，还不能用于临床常规检测。

现有技术CN2006100153835中公开了人促甲状腺素受体胞外区氨基端基因表达产物及制备方法和该产物在酶免技术中的应用。这种表达蛋白富含人TSAb的抗原决定簇，具有与人TSAb结合的免疫活性。所以本发明以重组hTSHR膜外区氨基端蛋白做抗原，以多孔位塑料板为固相载体的定量检测人TRAb(以TSAb为主)的荧光酶免疫技术，创建我国自己的检测TRAb且对TSAb和TSBAb能有所区分的检测技术十分必要，是广大临床医师的迫切要求。

【发明内容】

本发明的目的在于用重组hTSHR膜外区氨基端蛋白做抗原包被于酶标板上制备固相酶标板，以此建立板式固相定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA技术。

本发明为实现上述目的所采用的方案是设计一种定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法，其特征在于用重组hTSHR膜外区氨基端蛋白做抗原包被多孔板，用含1-5％BSA的PBST封闭；然后再以多孔板做载体加入抗hTSHR第一抗体或标准品、再依次酶标第二抗体、荧光底物和终止液，最后在荧光发光分析仪上测定荧光强度。

本发明定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法的用途，用于检测以TSAb为主的TRAb荧光酶免法FEIA。定量检测人TRAb(以TSAb为主)的荧光酶免疫法，可做为临床GD甲亢的病因诊断、疗效观察和确定停药时机的重要指标。

本发明的积极效果：

1、以重组hTSHR膜外区氨基端蛋白做抗原包被在固相载体多孔板上，进而用此成功地建立了定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA。

2、建立的板式固相定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA是把酶联免疫分析ELISA与荧光检测技术结合起来，具有高度的敏感性和特异性，操作方便、准确、稳定，可以同时进行大量标本的检测，并可在荧光分析仪上迅速读出结果。而且多孔位塑料板来源方便，价格低廉，易于临床推广应用。

3、建立的板式固相定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA已用于临床检测自身免疫性甲状腺病，特别对GD甲亢的病因诊断、疗效观察和确定停药时机有重要价值，对鉴别自身免疫性和非自身免疫性甲状腺病也有重要的临床意义。

【附图说明】

图1为TRAb标准曲线；

图2为hTSHR膜外区氨基端蛋白抗原与人TRAb和hTPOAb结合反应曲线；

图3为平行实验曲线图；

图4为相关性检测曲线图；