[发明专利]S100A4蛋白的基因优化与高效表达

权利要求书

1.一种S100A4蛋白基因序列，其特征在于优化后的S100A4序列与原序列相比，37个碱基被替换，序列中所有的E.coli低频密码子均被高频密码子所替换。

2.根据权利要求1的S100A4蛋白分子，其特征在于具有序列表中序列1所示的碱基序列。

3.编码权利要求1的S100A4蛋白分子的基因，其特征在于具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。

4.权利要求1或2所述的S100A4蛋白分子的基因优化与高效表达，其特征在于包括如下步骤：

(1)S100A4序列的优化设计与引物合成：

(2)PCR合成优化后S100A4序列并与表达载体pBV-220连接；构建pBV220-S100A4表达载体；

(3)在大肠杆菌DH5α中进行高效表达；

5.根据权利要求4的制备方法，其特征在于步骤(2)所述表达载体是PBV220。

6.根据权利要求4的制备方法，其特征在于步骤(3)所述大肠杆菌是E.coli DH5α。

附：权利要求特征的详细步骤

S100A4蛋白的基因优化与高效表达，其特征包括如下步骤：

(1)S100A4序列的优化设计与引物合成：

①根据大肠杆菌偏好密码子，利用Condonopt密码子优化软件优化从GenBank中检索到的S100A4基因序列；

②全部选用偏好密码子，设计合成S100A4序列的引物。

③为了便于蛋白表达，在两端引物分别引入了EcoR I和BamH I的酶切位点，同时在3’末端引入6×His标签以利于进一步纯化。

(2)PCR合成优化后S100A4序列

PCR法合成。

(3)克隆载体pEasy-S100A4的构建

将优化的S100A4基因序列TA克隆至pEasy-T3载体上构建克隆载体pEasy-S100A4，转化到E.coli DH5α中，PCR筛选阳性转化子，提取质粒酶切鉴定后送invitrogen公司测序。

(4)表达载体pBV220-S100A4的构建

①以测序正确的质粒为模板，以pfu酶进行PCR扩增引入酶切位点。

②用BamH I、EcoR I双酶切S100A4纯化后的PCR产物，所得产物与pBV-220质粒连接并转化到表达宿主E.coli DH5α中，PCR筛选阳性转化子。

(5)在大肠杆菌DH5α中进行高效表达

①将阳性单克隆菌，接种于5mL含氨苄西林的LB培养基中，30℃，180r/m过夜培养。 

②次日将过夜培养的菌液按1∶50的比例重新转接500mL的LB(含Amp)培养基中。30℃条件下，180rpm振荡培养至A₆₀₀≈0.8后，升温至42℃继续振荡培养4-4.5h后，以5000rpm收集菌体，用后续纯化用液体重悬菌体，进行超声破碎菌体。超声破碎条件：功率200W，超声处理10s，间隔15s，循环90次。

③破碎后，4℃ 6000rpm离心15min，分别收集上清和沉淀。