[发明专利]S100A4蛋白的基因优化与高效表达

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白制备方法。具体的说，本发明涉及S100A4基因优化与高效表达方法。

背景技术

S100A4蛋白是以非共价键结合二聚体存在于细胞内，而以共价结合二聚体分泌到细胞外。推测Ca²⁺结合后可导致S100A4蛋白构型改变，在表面暴露出新的结合位点，从而可与一系列靶标结合。胞外基质中的S100A4蛋白是一种单体和二聚体共存的状态，其比例受Ca²⁺结合程度的影响；胞内S100A4蛋白的同源二聚体和异源二聚体形式也是同时存在。因此，从S100A4蛋白可形成同源二聚体、异源二聚体、寡聚体的多种形式来看，其结构具有很强的可变性，这可能也是它在体内具有多种生物学功能的结构基础。

本研究采用全基因合成法合成S100A4基因。并根据大肠杆菌偏好密码子，利用Condonopt密码子优化软件优化从GenBank中检索到的S100A4基因序列，全部选用偏好密码子，设计合成S100A4序列的引物。为了便于蛋白表达，在两端引物分别引入EcoR I和BamH I的酶切位点，同时在3’末端引入6×His标签以利于进一步纯化。

发明内容

本发明提供了一种制备并优化S100A4基因的方法。

本发明优化后的S100A4序列与原序列相比，37个碱基被替换，序列中所有的E.coli低频密码子均被高频密码子所替换。

本发明还公开了一种编码S100A4蛋白分子的基因，该基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。

本发明还公开了上述S100A4蛋白分子的基因制备方法。该方法包括如下步骤：

(1)S100A4序列的优化设计与引物合成：

(2)PCR合成优化后S100A4序列并与表达载体pBV220连接，构建pBV220-S100A4表达载体；

(3)在大肠杆菌DH5α中进行高效表达；

制备S100A4蛋白编码基因可以按照实验室常规方法进行，优选PCR法。优选PCR重叠引物延伸法(黄培堂等译，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，分子克隆实验指南第三版，p1091-1113)。所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业PET系列载体和国内广泛使用的PBV220载体，优选PBV220载体。大肠杆菌可以是适合原核系统表达的配套大肠杆菌，当使用PET类载体，宿主菌优选E.coli BL21(DE3)系列；当使用PBV220载体时宿主菌可选择多种商业上提供的大肠杆菌，优选E.coli DH5α。

本发明根据大肠杆菌偏好密码子设计并合成S100A4序列的引物，PCR扩增优化后的S100A4序列克隆至载体pEasy-T3上，构建克隆载体pEasy-S100A4。测序后，将该序列克隆至表达载体pBV220并转化至DH5α。在热激诱导下，在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达。

附图说明

图1为S100A4序列中被替换的碱基示意图

图2为合成S100A4基因的PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳。

图3为测序结果与优化后的S100A4序列的比较

图4为菌落PCR法鉴定重组阳性pEasy-S100A4克隆

图5为克隆载体pEasy-S100A4的酶切鉴定

图6为菌落PCR法鉴定阳性pBV-220S100A4克隆

图7为表达载体pBV220-S100A4的酶切鉴定

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒与菌株

克隆载体pEasy-T3购自北京全式金公司；表达载体pBV220、大肠杆菌E.coli DH5α由本实验保存。

1.1.2酶及主要试剂

胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、BamH I、EcoR I及T4DNA Ligase均购自Promega公司；Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、DL2000核酸分子量标准物购自北京TIANGEN公司，低分子量蛋白标准物购自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1S100A4序列的优化设计与引物合成

①根据大肠杆菌偏好密码子，利用Condonopt密码子优化软件优化从GenBank中检索到的S100A4基因序列(如下图1所示)；

②全部选用偏好密码子，设计合成S100A4序列的引物(表1)。