[发明专利]用于恶性肿瘤基因治疗的增殖和肿瘤细胞特异性基因操纵系统

说明书

【技术领域】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高度增殖特异性重组真核细胞启动子 (PCNATAI)；一套以PCNATAI作为基因转录的启动子，由肿瘤细胞特异性启动子启动表达的Cre 重组酶激活，以高度增殖特异性和肿瘤细胞特异性双重依赖模式，启动外源性治疗基因在恶性肿瘤 细胞中高效特异性表达的真核细胞操纵系统；以及用该操纵系统各组成部分构建的相应真核细胞表 达质粒载体、重组腺病毒穿梭质粒载体和重组腺病毒表达载体。

【背景技术】恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病，在全世界人口死亡原因中位居第三， 自2006年起恶性肿瘤已经成为我国城乡居民死亡的首要原因。目前恶性肿瘤的治疗仍采用手术切 除为主，放、化疗为辅的综合治疗方法。因恶性肿瘤呈浸润性生长，手术不易全切；放、化疗不 仅难以达到满意的疗效，还会给患者带来难以耐受的全身性毒、副作用；故寻求有效的治疗新途 径势在必行。近来的研究显示，基因治疗有可能成为未来恶性肿瘤治疗的有效手段，并展示出诱 人的光明前景，但高效表达和可靠的安全性是决定基因治疗成功的先决条件。然而，现有基因治 疗载体不但表达效率低，且特异性差；既不能在肿瘤细胞中高效表达，又不能将治疗基因的表达 严格限定于肿瘤细胞中；因而不但治疗效果不理想，还会造成肿瘤周围组织中乃至全身多种正常 细胞的损伤，这是制约恶性肿瘤基因治疗的瓶颈。因此，构建安全、高效的肿瘤细胞特异性治疗 基因表达载体是恶性肿瘤基因治疗亟待解决的问题^[1]。

高度增殖是所有恶性肿瘤细胞的共同特征，而肿瘤周围组织的正常细胞绝大多数处于非增殖 状态。人增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)为全增殖期细胞特异性高表达的 标志物，在所有恶性肿瘤中的阳性表达率均为100％，其表达水平与肿瘤的恶性程度呈正比，而肿 瘤周围组织中处于非增殖状态的正常细胞不表达PCNA^[2]。说明恶性肿瘤细胞中有高效激活PCNA 基因启动子的微环境；肿瘤周围组织中处于非增殖状态的正常细胞内不具备激活PCNA基因启动 子的条件；PCNA基因的启动子为严格的增殖特异性启动子，其转录水平与细胞的增殖活性及肿 瘤的恶性程度成正相关，符合肿瘤特异性基因治疗对增殖特异性的要求。故利用PCNA基因启动 子启动外源性治疗基因的表达，不但可使外源性治疗基因在恶性肿瘤细胞内高效表达，还可将外 源性治疗基因的表达限定在处于高度增殖状态的恶性肿瘤细胞内。通过这种增殖特异性的限制， 既可使外源性治疗基因的表达能有效杀伤恶性肿瘤细胞，又可防止外源性治疗基因损伤处于非增 殖状态的正常细胞。

目前已明确PCNA基因启动子属于典型的看家基因启动子，其核苷酸序列的-900～+60区段中 (启动子区DNA序列编号以转录起始位点的核苷酸编号为+1，起始位点上游邻近核苷酸编号为 -1，并向5’方向编号绝对值依次递增；起始位点下游邻近核苷酸编号为+2，并向3’方向编号依次 递增)存在多种反式作用因子的结合位点。我们用增强绿荧光蛋白(EGFP)报导系统，对PCNA 基因启动子核苷酸序列-900～+64区段在多种人恶性肿瘤细胞系及体外培养大鼠星形胶质细胞中的 转录效率和增殖特异性进行了检测。初步证实，用携带PCNA基因启动子-900～+64区段核苷酸序 列及受其调控的下游EGFP报道基因的真核细胞表达质粒转染人恶性肿瘤细胞系后，可高效启动 报道蛋白EGFP的表达；而转染该真核细胞表达质粒的体外培养大鼠星形胶质细胞几乎不表达 EGFP。以上结果说明PCNA基因启动子核苷酸序列的-900～+64区段具备了必要的增殖特异性和 转录活性。对其进行合理的优化改造将有可能制备出一个适用于多种恶性肿瘤基因治疗的广谱增 殖特异性启动子。我们经过分段筛选，进一步确定其核苷酸序列的-778～+61区段不但增殖特异性 最好，且对下游受其调控基因的转录启动活性最强，可作为以增殖特异性模式启动外源性治疗基 因表达的核心启动子。