[发明专利]利用基因工程菌株耦合发酵合成GDP-甘露糖体系的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是基因工程领域中基因工程菌株的构建技术，尤其是一种利用基因工程菌株耦合发酵合成GDP-甘露糖体系的构建方法。

背景技术

WHO对来源于14个国家的36项调查发现，在出生后6个月内，母乳喂养婴儿的痢疾发生率比非母乳喂养婴儿平均低4-5倍。

母乳之所以能够有效降低新生婴儿痢疾的发病度和死亡数，主要归因于其含有抗感染、抗炎症等多种免疫调节因子，主要包括分泌型抗体(sIgA)、寡糖、乳铁蛋白、白细胞、细胞因子等。由于新生婴儿的免疫系统在2周岁之前未能完全发育成熟，母乳中这些因子可通过干扰病原菌在肠道上的粘附、调节机体对病原菌的炎性反应、刺激肠道系统和免疫系统的成熟而达到抵抗婴儿疾病的目的。

人乳寡糖的含量在乳糖、脂类之后，为人乳中第三大物质。研究表明，母乳喂养或用添加有人乳寡糖的母乳替代品喂养的婴儿，其粪便中的有害细菌数大大降低；同时，与通常母乳替代品喂养婴儿相比，因细菌感染而引起的死亡率也明显降低。由此可见，人乳寡糖具有明显的抗感染和某些重要的非特异性免疫学功能，一些研究也证明了人乳寡糖能促进婴儿消化道中双岐杆菌的增殖，并使梭状芽胞杆菌和肠球菌的数量大大减少。

人乳寡糖的抗病原菌粘附功能引起了人们的广泛关注，许多医药公司也开始进行以人乳寡糖及其类似物的抗粘附药物的开发与临床研究，但是，人乳寡糖的大量获得并不容易。目前，关于人乳寡糖的功能与制备研究在我国仍未得到有效开展，我国对功能寡糖类物质的开发主要集中在对天然植物、微生物多糖采用酸、碱、酶、氧化等化学方法进行降解制备低分子量的寡糖，如壳寡糖、果寡糖等，这类产品目前已成功上市。对寡糖药物的开发虽也在不断进行中，但仅是用化学合成方法进行制备，并且大多数工作仅处于研究阶段。也有研究单位或企业通过微生物发酵方法生产一些低聚糖类，但仅是利用微生物体内正常酶系进行生产，而对通过基因工程技术开发寡糖的研究还未进行。随着越来越多的糖苷酶及其基因的不断解析以及微生物代谢调控路线的不断阐明，构建代谢工程菌生产结构特定、功能明确的寡糖成为可能。但是，如何获得大量廉价的糖基供体对于寡糖的制备也是至关重要的。目前，无论化学法或酶法合成寡糖，其所需糖基供均体价格不菲。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用基因工程菌株耦合发酵合成GDP-甘露糖体系的构建方法，该构建方法利用E.coli表达系统，对以甘露糖为底物合成GDP-甘露糖的相关酶进行高效表达，利用基因重组技术构建含这三种酶的重组大肠杆菌菌株，进行耦合发酵作用合成GDP-甘露糖的方法，该方法构建的工程菌株能增加三个酶基因的拷贝数，提高酶的表达量，从而能作用于底物甘露糖合成GDP-甘露糖。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用基因工程菌株耦合发酵合成GDP-甘露糖体系的构建方法，构建方法包括以下步骤：

(1)基因扩增：根据大肠杆菌K-12基因组中己糖激酶基因glk、磷酸甘露糖变位酶基因manB和甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶基因manC的序列设计引物，扩增出大肠杆菌中的三个酶基因序列；

(2)重组质粒的构建：用酶切连接的方法分别将上述三种目的基因与载体pET-22b相连，得到携带酶基因的重组表达载体，并进行双酶切验证；

(3)基因工程菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化入宿主菌株BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的三种基因工程菌株；

(4)混合发酵合成GDP-甘露糖：三个基因工程菌株的混合发酵，通过改变细胞通透性使工程菌株的产物作用于甘露糖合成GDP-甘露糖。

而且，所述步骤(3)的三种基因工程菌株分别为：BL21(DE3)/pET-22b-glk、BL21(DE3)/pET-22b-manB和BL21(DE3)/pET-22b-manC。

而且，所述步骤(4)混合发酵培养基的组成成分为g/L：BL21(DE3)/pET-22b-gL湿重25；BL21(DE3)/pET-22b-manB湿重15；BL21(DE3)/pET-22b-manC湿重25；甘露糖30；植酸5；KH₂PO₄ 25；MgSO₄.7H₂O 5；ATP 5；Nymeen S-215 4。

本发明的积极效果：