[发明专利]具有结合组蛋白去乙酰化酶1特性的氨基酸序列及其表达载体无效
申请号: | 200910070689.4 | 申请日: | 2009-09-29 |
公开(公告)号: | CN101787075A | 公开(公告)日: | 2010-07-28 |
发明(设计)人: | 李政 | 申请(专利权)人: | 天津医科大学附属肿瘤医院 |
主分类号: | C07K14/435 | 分类号: | C07K14/435;C12N15/70;C12N15/85;A61P35/00;C12R1/19 |
代理公司: | 天津市宗欣专利商标代理有限公司 12103 | 代理人: | 董光仁 |
地址: | 300060 *** | 国省代码: | 天津;12 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 具有 结合 组蛋白 乙酰化 特性 氨基酸 序列 及其 表达 载体 | ||
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体是具有结合组蛋白去乙酰化酶1特性的氨基酸序列及其表达载体。
背景技术
细胞周期负调控蛋白p21主要通过抑制细胞周期素依赖性激酶的活性调控细胞周期,在转录水平上受p53抑癌基因的调节,缺乏p21将导致DNA损伤后细胞周期G2/M节点功能严重破坏,提高p21的蛋白质表达水平则导致细胞周期阻滞在G1期。目前进入临床II期试验的一类抗癌药物(组蛋白去乙酰化酶抑制剂)如SAHA(suberoylanilide hydroxamicacid,N-羟基-N′-苯基辛二酰胺;伏立诺他)及一系列TSA(曲古菌素A,Trichostatin A)的衍生物等,共同的作用机理都是诱导癌细胞内p21蛋白质表达水平增加。
人源序列位于人类10号染色体10q26.2区的一段基因序列,恰好位于一个普通型染色体脆性位点FAR10F内,我们将其命名为FATS(Fragile-site Associated Tumor Suppressor)。该基因序列在抗肿瘤药物研发中的应用日益引起关注。
发明内容
本发明是为进一步研究FTAS抑癌分子机理,以及为FATS在抗肿瘤药物研发中的应用,而提供一段FATS蛋白序列中进化上保守,具有结合组蛋白去乙酰化酶1特性的氨基酸序列及其表达载体。
一段氨基酸序列,该氨基酸序列具有特异性结合组蛋白去乙酰化酶1的特性,所述氨基酸序列如图1a、图1b所示。
所述的一段氨基酸序列,该氨基酸序列还包含一段进化上极端保守序列:GFS/ASITITARRVGPPA,并在人、小鼠、大鼠、牛、狗中高度同源。
所述的一段氨基酸序列,该氨基酸序列在细胞内的表达,增加p21蛋白的乙酰化修饰,从而抑制p21蛋白的降解。
一段氨基酸序列表达载体的制备方法,其是将mini-FATS双链核酸序列以平末端正向连接到pcDNA3载体中CMV启动子下游,转化感受态大肠杆菌DH5α,铺平板过夜培养,挑取转化菌扩增培养提取质粒,酶切测序验证插入序列;mini-FATS双链核酸序列通过PCR扩增得到,引物序列为5′-CTGGCATCACAGAACACAAGAATGA-3′和5′-CTACTCACCAGCCCTGTAACTCCAG-3′,得到表达载体pcDNA3-FATS。
一段氨基酸序列的表达载体,将编码该氨基酸序列的pcDNA3-FATS表达载体转染细胞后,特异性诱导细胞周期抑制性蛋白p21的表达水平上升。
本发明的有益效果是:本发明证实目前进入临床实验的一类抗癌药物,即抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的小分子化合物的抗癌作用靶点,并证实一个新的内源性蛋白FATS的抑癌机理与目前所用的HDAC抑制性药物的抗癌机理类似,从而为研发新一代更特异的抗HDAC1化学药物提供了天然模拟靶点。
附图说明
图1a是具有结合组蛋白去乙酰化酶1的特性的鼠源氨基酸序列;
图1b是具有结合组蛋白去乙酰化酶1的特性的人源氨基酸序列;
图2a是pcDNA3-FATS表达载体构件示意图;
图2b是GST-mini-FATS融合表达载体构建示意图;
图3是免疫印迹分析结果;
图4a、图4b是用cylcoheximide(CHX)抑制蛋白质合成后,用免疫印迹分析p21蛋白质表达水平的变化;
图5是GST融合蛋白结合HDAC1实验结果;
图6是GST-mini-FATS缺失突变蛋白结合实验的结果示意图;
图7是免疫沉淀和免疫印迹检测p21蛋白乙酰化的实验结果;
图8是HDAC1结合p21蛋白的实验结果;
图9是免疫沉淀和免疫印迹检测FATS抑制HDAC1结合p21蛋白的实验结果。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
一.实验材料来源:
小鼠NIH3T3和人Hela细胞购自美国American Type CultureCollection(ATCC)。表达载体pcDNA3购自Invitrogen公司。Cycloheximide(CHX)购自Sigma公司。针对p21和p27的抗体购自BDPharmigen。针对Actin和Flag的抗体购自Sigma公司。针对乙酰化赖氨酸(Ac-K)的抗体购自Upstate公司。
二.实施方法
1.pcDNA3-FATS表达载体构建
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