[发明专利]一种碱性果胶酶基因工程菌培养条件的优化方法

说明书

技术领域

本发明属微生物工程领域，尤其是一种碱性果胶酶基因工程菌培养条件的优化方法。

背景技术

果胶酶(pectinase)是一类分解果胶质的酶的总称，是含有多种组分的复合酶。果 胶酶广泛分布于高等植物和微生物中，但从植物中提取受到资源、技术水平的诸多限制而 一直未能真正实现产业化，因此微生物来源的果胶酶成为研究热点。国内外对酸性果胶酶 的研究已经具有一定基础，但是对碱性果胶酶尤其是果胶裂解酶(pectate lyase)的研 究报道较少。

碱性果胶酶是指最适作用pH在碱性范围内的果胶酶，是果胶酶研究领域中的新兴内 容，主要应用于纺织工业中用作对环境友好的生物催化剂，用柔和的酶生物精练代替传统 的碱高温蒸煮技术，实现绿色清洁生产，既可减少碱排放污染，又可降低加热能耗和漂洗 用水量，同时提高纺织物的加工和使用性能。因而随着生物技术的不断快速发展，碱性果 胶酶在纺织工业中的应用潜力也越来越受到大家的关注。

从1972年Horikoshi，K.发表第一篇关于芽孢杆菌生产碱性果胶酶的论文开始，日 本等国开始致力于碱性果胶酶的研究。印度Mukesh Kapoor于2001年报道了Bacillus sp. MG-cp-2碱性聚半乳糖醛酸酶的生产、纯化和酶学性质，确定该菌株发酵活力为47u/mL， 培养基优化后活力提升为98u/mL，室温时在pH7.0～12.0范围内稳定，可有效应用于苎 麻和菽麻纤维脱胶；德国学者2004年测定了果胶酶菌种Bacillus licheniformis DSM13 的基因组序列。美国、荷兰、英国、西班牙等国的学者也分别对碱性果胶酶的菌种资源、 发酵、纯化方法、酶学性质、分泌调控及分子生物学等内容进行了报道，研究对象除了上 述芽孢杆菌之外，还包括一些植物病原菌，如菊欧文氏菌、洋葱伯克霍尔德菌等。

为了获得高产、优质的碱性果胶酶产品，自1990年以来，国外学者把研究重点从筛 选产碱性果胶酶菌种方面逐步转向产酶基因及基因工程菌的研究上，尤其是随着1999年 丹麦Novo Nordisk(诺和诺德)碱性果胶酶Bioprep(是一种基因改良的芽孢杆菌经发酵 制成的酶制剂，其最适pH值为7.5～9.5，适用温度为55℃左右)和碱性果胶裂解酶 ScourzymeL(最佳pH值为7.5～9.5，对温度的选用则根据pH值而定，如pH值在8～8.5 时，温度掌握在55℃～60℃)的产品问世，人们将注意力越来越多地转向了酶基因及其 克隆技术的研究。西班牙、法国、荷兰、日本学者分别将Bacillus sp.(2000年)、Erwinia chrysanthemi3937、Thermotoga maritima(海栖热袍菌，2003年)、Bacillus subtilis (2002年)四种菌株的碱性果胶酶基因克隆到大肠杆菌中成功进行了表达。

国内对果胶酶的研究始于20世纪60年代，1990年初开始对碱性果胶酶进行研究， 大量文献对果胶酶菌种的筛选、传统诱变育种、生产工艺和酶的工业应用等方面做了报道， 但关于碱性果胶酶的发酵、酶制剂制备和分子生物学遗传育种方面的研究内容较少。菌种 主要是芽孢杆菌，如吉氏芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌No.46、XZ2、B13、 LH-16、WSHB04-02以及小芽孢杆菌WSH03-09、RK9等，此外还有嗜盐嗜碱菌 Alkalibacterium sp.F26等。2006年我国学者甄东晓等将Clostridium stercorarium(耐 热梭状芽孢杆菌)的耐热果胶裂解酶基因pel9A克隆到表达载体pET28α然后转化大肠杆 菌进行表达；同年，诸葛斌等利用温控载体构建了碱性果胶酶工程菌。越来越多的研究单 位在基因工程菌应用于工业生产的总体趋势下进行了碱性果胶酶分子生物学操作的有效 尝试，大多分子生物学操作或以大肠杆菌表达体系为主要内容，或以枯草芽孢杆菌表达体 系为研究对象，但大多载体和宿主的选择在以生产为目的时均显示了某种不足，例如温控 载体和穿梭质粒的使用会因表达中需要温度、诱导剂等条件而增加生产成本。

我国碱性果胶酶研究总体起步较晚，在国外酶制剂公司80％的工业用酶都是由基因工 程菌发酵生产获得，本发明在成功构建一株碱性果胶酶基因工程菌后，力求寻找到产酶量 较高的发酵培养方法，以拓宽民族工业酶制剂的竞争和发展空间。

发明内容