[发明专利]一种多农兽药残留的高通量检测方法

权利要求书

1.一种多农兽药残留的高通量检测方法，其特征是包括如下步骤：

(1)待测农兽药靶分子蛋白结合物的制备：

采用重氮化法将氯霉素、克伦特罗分别与载体蛋白BSA制成蛋白结合物；

采用碳二亚胺法将吡虫啉与载体蛋白BSA制成蛋白结合物；

采用活性酯法将甲萘威与载体蛋白OVA制成蛋白结合物；

采用混合酸酐法将阿特拉津、雌二醇分别与载体蛋白BSA制成蛋白结合物；

通过羰基二咪唑将泰乐菌素与载体蛋白BSA制成蛋白结合物；

(2)待测农兽药靶分子蛋白结合物在羧基荧光微球上的偶联和确证

1)将步骤(1)制备的待测农兽药靶分子蛋白结合物分别放入七支Eppendorf离心管中为实验管，并将所述步骤(1)中与待测农兽药靶分子结合的载体蛋白对应地放入另七支Eppendorf离心管中，为所述对应的实验管的阴性对照管，再向所述实验管和阴性对照管中加入1800～2300个偶联微球，以中速漩涡振荡12-20s；

2)在各实验管中加入相对应的生物素化抗体3～10μg；在阴性对照管中加入相同容积的磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered saline，PBS)；于37℃孵育箱中速振荡反应1～2h；

3)10000～16000g离心实验管和对照管3～5min，弃上清；

4)加入100×稀释的链霉亲和素-藻红蛋白(Strepavidin-phycoerythrin，SA-PE)，于37℃孵育箱中速振荡反应20～40min；

5)将反应后的溶液移入96孔酶标板中，放进已预热的Bio-Plex^TM悬浮芯片仪，通过配套的Bio-Manager^TM 4.0软件选取相对应的微球编码，上机读数，获得中位荧光强度值(Mean Fluorescent Intensity，MFI)；MFI＞1000，可确证偶联成功；

(3)农兽药残留的悬浮芯片单通道检测方法建立

将各种待测的农兽药标准品氯霉素、克伦特罗、吡虫啉、甲萘威、阿特拉津、雌二醇和泰乐菌素用水分别进行梯度稀释(梯度可详见说明书中的表1)，同时设不加任何标准品的阳性对照；加入新的96孔酶标板中，再在各孔分别加入相对应的生物素化抗体3～10μg；然后，各孔分别加入相对应的所述步骤(2)获得的偶联有蛋白结合物的荧光微球1800～2300个，反应1～2h，向每孔加入100×稀释的SA-PE，37℃温育20～40min，悬浮芯片读取100个微球，由配套的Bio-Manager^TM4.0软件分析处理，获得MFI，并采用Logistic回归方程获得7种待测农兽药的最小可检出浓度和检测区间；

(4)高通量悬浮芯片同时对多农兽药残留的检测

再重新取96孔酶标板加入各种待测农兽药的多种生物素化抗体3～10μg，多种农兽药标准品依次按照不同的浓度梯度进行稀释，将步骤(2)所获得多种微球等比例混合，每孔1800～2300个，最后每孔用PBS补足50μL，同时每种检测物准备一阳性对照，反应为漩涡振荡器上37℃中速振荡1～2h，然后每孔加入50×稀释的SA-PE 50μL，25℃中速振荡反应0.5～1h，悬浮芯片读取100个微球，获得MFI，分析处理并做出7种待测农兽药检测标准回归曲线方程；

(5)农兽药残留样品的检测分析

准备若干种不同浓度的农兽药盲样，对每个盲样平行测试3次(n＝3)，用Bio-Plex^TM悬浮芯片系统检测出盲样中每种待测农兽药的MFI，由Bio-Manager^TM 4.0软件根据步骤(4)绘制出的标准曲线计算出测试浓度值，测得被测样品中农兽药浓度。并将测试结果和实际浓度值进行比对。