[发明专利]胆汁三烯结合蛋白(BBP)的序列优化和高效表达

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白分子的制备方法，具体的说，本发明涉及一种具有高效表达活性的胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子的制备方法。 

背景技术

某些有毒有害小分子化合物如农药、兽药的残留等，是产生食品安全问题的主要因素，如何制备特异识别的小分子化合物的配体已经成为研究关注的热点问题。研究发现，胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子(bilin binding protein，BBP)对小分子具有较强的结合能力，具有重要的生物学功能，可用于运输和储藏次级代谢产物。BBP是以小分子受体蛋白-脂质运载蛋白(1ipocalin)为骨架的蛋白，蛋白质折叠成β桶状，提供了一个疏水的口袋结构，以便结合和运输疏水性小分子。与抗体相比，BBP结合小分子有独特的优点：BBP分子骨架构象更适合与小分子物质结合，而抗体是免疫系统针对大分子物质应激产生的蛋白，其构象上更适合与大分子物质结合；BBP片段比抗体小，通过基因工程更容易对其进行操作，无需免疫动物、细胞融合等复杂制备过程；BBP口袋型识别位点具有很大的分子接触表面，结构稳定，避免了免疫球蛋白轻重链的非共价键结合。(Schlehuber S，Skerra A.Tuning ligandaffinity，specificity，and folding stability of an engineered lipocalin variant-a so-called‘anticalin’-using a molecular random approach[J].biophys chem，2002，96(2-3)：213-228)。Beste等以BBP为骨架基础，结合噬菌体表面展示技术，构建了随机突变肽库，筛选到3个对荧光素有特异吸附的突变体，亲和力高达35.2nmol/L，且交叉反应率低。BBP最初是从大菜粉蝶(Pieris brassicae)中得到的，其提取困难，成本高，提取效率低。因此，利用基因工程方法高效表达BBP分子，对筛选小分子模拟抗体的研究具有重要的意义。 

发明内容

为克服上述野生型BBP制备的缺点，降低其制备成本并有效保持其活性，本发明提供了一种制备并纯化胆汁三烯结合蛋白(BBP)的方法及其多克隆抗体的制备方法。本发明的新型胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子，是优化后的野生型的BBP分子，其序列与原序列相比，57个 碱基被替换，序列中所有的大肠杆菌低频密码子均被高频密码子所替换。与野生型BBP相比，优化后的胆汁三烯结合蛋白(BBP)基因更适合在大肠杆菌中实现功能表达；本发明公开了一种具有序列表中序列1所示新型胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子本发明还公开了一种编码新型胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子的基因，该基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。本发明还公开了上述胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子的制备方法。该方法包括如下步骤： 

(1)对野生型BBP序列的优化设计与引物合成； 

(2)PCR合成优化后BBP序列并与表达载体连接构建pBV220-BBP表达载体； 

(3)纯化蛋白用BCA方法进行蛋白定量(汪家政，范明.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社，2000，51-54.)。； 

(4)胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子的分离纯化；