[发明专利]根癌农杆菌介导的甘油氧化酶高产菌株的转化及筛选方法

说明书

【技术领域】：本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产甘油氧化酶的日本曲霉菌株以及根癌农杆菌介导的日本曲霉转化方法。

【背景技术】：曲霉属包括灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)群、白曲霉(Aspergillus candidus)群、黄曲霉(Aspergillus flavus)群、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)群、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)群、棕曲霉(Aspergillus ochraceus)群、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)群、黑曲霉(Aspergillus niger)群等等。其中黑曲霉群中的很多种，如黑曲霉(Aspergillus niger)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)等都具有强大的酶系统，目前已经广泛应用于工业大规模生产各种生物酶制剂，包括淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶等。黑曲霉群的发酵工艺已经十分成熟。

实际人们对于这些酶还没有充分利用，所受到的主要限制之一就是，产生的某些酶酶活太低而没有实用价值。目前，很多研究者已经分别采取物理、化学诱变、原生质体融合以及分子生物学手段来对菌种进行改良，以期得到具有优良产量性状的菌株。

日本曲霉(Aspergillus japonicus)属于半知菌纲，从梗孢目，从梗孢科，曲霉属的黑曲霉群，分布十分广泛，可以在棕桐油、空气、土壤中分离得到。其菌落生长较快，10天直径就可达5-6厘米，绒状，紫褐色，反面幼时无色，后变为淡紫褐色。分生孢子头球形，老后散列成几个松柱状结构，分生孢子梗光滑，顶囊球形或稍长，小梗单层，分生孢子球形或近球形，有明显的小刺。有些菌系产生白色或奶油色的球形菌核，是黑曲霉群中单层小梗的代表类型。

目前发现日本曲霉可以产生甘油氧化酶GLOX，并且日本曲霉产生甘油氧化酶的活力最高，虽然青霉中也可以产生GLOX，但是产生的GLOX结合在菌丝体细胞的表面，难于分离，且很不稳定，不适合生产的需要。所以日本曲霉有作为工程菌株生产甘油氧化酶的潜力，但日本曲霉的基因组序列尚未测通，其中与甘油氧化酶代谢相关的基因目前也还未知，并且甘油氧化酶的产量也相对较低，所以需要建立一套有效的遗传转化体系，这样不仅可以为日本曲霉功能基因的分子生物学研究提供前提，也可以为日本曲霉优良性状菌株的育种提供手段，同时也为曲霉属其他的种提供分子生物学研究方法。

根癌农杆菌介导法首先应用于植物的遗传转化，并由Bundock首先应用于酿酒酵母的遗传转化，之后在丝状真菌中得到了广泛的应用，为丝状真菌的研究奠定了基础。但目前对于日本曲霉还没有根癌农杆菌介导的遗传转化体系的报道。

【发明内容】：本发明目的在于提供一种高产甘油氧化酶的日本曲霉菌株。本发明的另一目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种根癌农杆菌介导的日本曲霉的转化方法及甘油氧化酶高产菌株的筛选。

本发明提供的日本曲霉菌株(Aspergillus japonicus)Ajyz0079，属于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，半知菌纲(Sphaeropsidales)，从梗孢目(Moniliales)，从梗孢科(Moniliaceae)，曲霉属(Aspergillus)。其菌落生长较快，10天直径就可以达到5-6厘米，绒状，紫褐色，反面幼时无色后变为淡紫褐色。分生孢子头球形，老后散列成几个松柱状结构，分生孢子梗光滑，顶囊球形活稍长，小梗单层，分生孢子球形或近球形，有明显的小刺。

本发明提供的根癌农杆菌介导的甘油氧化酶高产菌株的转化及筛选方法，包括以下步骤：

第一、将载体质粒通过三亲杂交的方法导入根癌农杆菌，其中所述的载体质粒为pBI-hphII，含有构巢曲霉启动子PtrpC和相应的终止子TtrpC，在启动子的下游含有潮霉素B抗性基因；

第二、将上步得到的含有载体质粒的根癌农杆菌和日本曲霉混合培养于含有诱导剂乙酰丁香酮的IM固体培养基上的微孔滤膜上，培养3天后，转移到含有潮霉素B和头孢霉素的察氏培养基中30℃培养得到潜在的转化子；

第三、将第二步得到的潜在的转化子在不含抗生素的培养基上传代后，再于含有潮霉素B和头孢霉素的培养基中培养，得到抗性遗传稳定的转化子。

第四、提取第三步得到的转化子的基因组，以潮霉素B抗性基因的特异性引物检测转化子的阳性，并以该抗性基因作为探针检测抗性基因的插入拷贝数。