[发明专利]人干扰素α-2b与人胸腺素α1的融合蛋白及其制备

说明书

技术领域：

本发明涉及一种人干扰素α-2b和人胸腺素α1的融合蛋白工程菌的构建以及融合蛋白的制备。

背景技术：

干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，具有抗病毒、抗增殖和免疫调节的功能。它并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。临床上用于治疗病毒性疾病、肿瘤和多发性硬皮病等。

人干扰素α有166或165个氨基酸组成，分子量为19000Da左右，目前已经克隆并确定氨基酸序列的人干扰素α亚成员有20种以上。干扰素具有很大的临床应用价值，对它的研究开发非常的深入。

胸腺素α1(thymosin alphal，Tα1)是从胸腺素组分5(TF5)中分离纯化出的，由28个氨基酸残基组成的酸性多肽，不含甲硫氨酸、半胱氨酸和芳香族氨基酸，其Mr为3108Da，pI4.2，N端被乙酰化，但其对活性影响不显著。在各种抗原或致有丝分裂原激活后，Tα1能够增加T细胞IFN，IL-2和IL-3等淋巴因子的分泌，增加T细胞表面淋巴因子受体的水平；Tα1还能影响NK前体细胞的募集，使其在暴露于淋巴因子后变得更有细胞毒性；在活体内Tα1能增加ConA激活后的小鼠淋巴细胞增加分泌IL-2并增加IL-2受体的表达作用；配伍其他细胞因子具有抗肿瘤作用。Tα1临床用途广泛，已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症及免疫缺陷等疾病的研究中，是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂。Tα1有巨大的医学价值，可治疗一些免疫系统受抑制或破坏的疾病，包括慢性乙肝、丙型肝炎、爱滋病、癌症等。目前国外化学合成的Tα1已临床应用，但成本高，价格昂贵。

Tα1作为一种免疫增强剂，临床用途广泛。目前市场出售的Tα1均为全人工合成，成本高、污染环境。而组织提取又受到材料来源的限制，且产量极低。人干扰素α-2b和胸腺素α1联合应用：

人干扰素α-2b和胸腺素α1的生物活性相辅相成，干扰素具有良好的抗病毒作用，是目前治疗慢性乙型肝炎较为有效的药物，但近期疗效仅为50％左右，且复发率较高；胸腺素α1可以促进T细胞及自然杀伤细胞的分化与成熟，并可促进病毒感染细胞表达病毒抗原，有利于HBV感染清除。所以干扰素与胸腺素α1的抗病毒作用在理论上有一定的互补性。经研究发现，二者联合应用已广泛证明对肝炎和肿瘤的治疗作用明显强于两者的单独使用。

虽然已证明人干扰素α-2b和胸腺素α1联合应用能大大提高包括慢性肝炎、肿瘤等疾病的治疗效果，但是由于这两种药品要分别生产，用药成本非常高。另一方面，在治疗过程中需分别注射这两种药物，不但延长了治疗周期，而且大大增加了患者的痛苦。由于这些原因，迫切需要开发一种能够兼容人干扰素α-2b和胸腺素α1生物活性的药物。美国专利US6319691公开了一种胸腺素α1和人干扰素α-2b的融合蛋白，在两个蛋白之间增加了一段连接肽，它既具有干扰素α的抗病毒活性，又具有胸腺素α1的免疫学活性，同时将生产两种药物的工艺简化为一个工艺。此专利只是利用本领域人员熟知的方法使用连接肽把两种蛋白质连接起来，并没有研究干扰素的结构与连接的关系。另外，2003年9月中国专利03156231.0公开了一种胸腺素α1和人复和干扰素的融合蛋白，同样在两个蛋白之间加上了一段连接肽，同样具有二者的活性。

本发明通过分析干扰素的结构，胸腺素α1连在人干扰素α-2b的C端不需要连接肽，根据大肠杆菌、酵母、CHO细胞等表达系统的密码子偏嗜性特点，人工合成IFNα-2b-Tα1融合蛋白的多个基因，使其能够在大肠杆菌、酵母、CHO细胞中高效表达。在大肠杆菌体内表达融合蛋白，大肠杆菌易于培养、扩增迅速、周期短、表达产物纯化简单、成本较低等优点，所获得的融合蛋白其干扰素比活性仍然在1×10⁸IU/mg。利用本领域人员熟知的技术，本发明的融合蛋白不局限于以大肠杆菌为宿主的表达。

我们把胸腺素α1连在人干扰素α-2b的N端不使用连接肽，人工合成T α1-IFN α-2b融合蛋白基因，同样使其在大肠杆菌里表达，表现为不能稳定的表达。分析原因是由于干扰素的第一氨基酸是半胱氨酸，如果直接连接到胸腺素α1后，会影响干扰素的正常折叠，从而影响其稳定表达。