[发明专利]氯化染料木素及其生物转化制备和应用方法

权利要求书

1.一种制备氯化染料木素的生物转化制备方法，其特征在于， 包括以下步骤：

A)将染料木素/染料木苷直接作为底物加入到培养基中与游动放线菌 Actinoplanes sp.HBDN08共培养中或将含有染料木素/染料木苷的碳氮源物质 的培养基与游动放线菌Actinoplanes sp.HBDN08共培养；

B)利用高压液相层析或萃取/硅胶层析方法分离纯化获得产物；

该方法制得的一种氯化异黄酮类化合物8-氯染料木素，3’，8-双氯染料木素， 结构式如下：

8-氯染料木素：R＝H；        3’8-双氯染料木素：R＝Cl。

2.根据权利要求1所述的氯化染料木素的生物转化制备方法，其特征在于：所 述的放线菌Actinoplanes sp.HBDN08为从土壤中分离得到的，是于2009年03 月11日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号 为：CGMCC NO.2944，命名为HBDN08 Actinoplanes sp.的菌株。

3.根据权利要求1所述的氯化染料木素的生物转化制备方法，其特征在于：所 述的放线菌Actinoplanes sp.HBDN 08的DNA序列为：

gtggaaagtt tttcggtctg ggatgggctc gcggcctatc agcttgttgg tggggtgatg 60

gcctaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ctgggactga 120

gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcggaagc 180

ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcag 240

ggacgaagcg caagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gccaactacg tgccagcagc  300

cgcggtaaga cgtagggcgc gagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag agctcgtagg  360

cggcttgtcg cgtcgaccgt gaaaactcgc agctcaactg cgagcctgcg gtcgatacgg  420

gcaggctaga gttcggtagg ggagactgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat  480

atcaggagga acaccggtgg cgaaggcggg tctctgggcc gatactgacg ctgaggagcg  540

aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgctgtaa acgttgggcg  600

ctaggtgtgg ggagcctctc cggttctctg tgccgcagct aacgcattaa gcgccccgcc  660

tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc  720

ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctgggtttg acatggccgc  780

aaaactgtca gagatggcag gtccttcggg ggcggtcaca ggtggtgcat ggctgtcgtc  840

agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc gttcgatgtt  900

gccagcgcgt tatggcgggg actcatcgaa gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg  960

ggatgacgtc aagtcatcat gccccttatg tccagggctt cacgcatgct acaatggccg 1020

gtacaaaggg ttgcgatgcc gtgaggtgga gcgaatccca aaaagccggt ctcagttcgg 1080

atcggggtct gcaactcgac cccgtgaagt cggagtcgct agtaatcgca gatcagcaac 1140

gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacgtcac gaaagtcggc 1200

aacacccgaa gccggtggcc taaccccgtt aggggaggga gccgtcgaag gtggggctgg 1260

cgattgggac gaagtcgtaa caaggtagcc gtaccgga 1298。

4.根据权利要求1所述的氯化染料木素的生物转化制备方法，其特征在于，包 括以下步骤：

游动放线菌Actinoplanes sp.HBDN08在种子培养2天后以体积百分比为 4％的接种量接入发酵培养基中，在28℃条件下250rpm振荡培养6天，发酵结 束后取样测定氯化染料木素的浓度；其涉及的详细步骤如下：

(1)斜面培养：将游动放线菌Actinoplanes sp.HBDN08接种到固体斜面培 养基上，28℃条件下，静置培养6天；

(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得到的斜面培养物，接种到液体种子 培养基中，在28℃条件下，250rpm培养2天，制得种子培养液；

(3)转化：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比4％的接种量接 入转化培养基中，在28℃条件下，250rpm培养6天；

(4)氯化染料木素的检测：转化结束后4000r/min离心收集上清液及细胞 沉淀，上清液经乙酸乙酯萃取，细胞沉淀加入3倍体积的甲醇浸泡过夜， 将乙酸乙酯萃取液和甲醇浸泡液合并，真空干燥后溶于乙醇中，经反相 高效液相色谱仪测定氯化染料木素的含量，计算8-氯染料木素及3’，8- 双氯染料木素的转化率分别为76.8％和12.8％；

在上述利用该游动放线菌转化生产氯化染料木素的方法中，固体斜面培养基 配方为：可溶性淀粉10g/L，酵母膏4g/L，水解酪蛋白3g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，琼脂20g/L，pH 7.2，120℃灭菌20分钟；

在上述利用该游动放线菌转化生产氯化染料木素的方法中，液体种子培养基 配方为：玉米淀粉24g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，葡 萄糖1g/L，碳酸钙4g/L，pH 7.0，装液量为250ml三角瓶装液25ml，120℃ 灭菌20分钟；

在上述利用该游动放线菌转化生产氯化染料木素的方法中，转化培养基配方 为：可溶性淀粉50g/L，葡萄糖20g/L，黄豆饼粉30g/L，氯化钠3g/L， 碳酸钙8g/L，pH 7.2，装液量为250ml三角瓶装液25ml，120℃灭菌20分 钟，培养基中的黄豆饼粉可被其它含有染料木素/染料木苷的碳氮源所代替。