[发明专利]布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒

权利要求书

1.一种布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒，其 特征在于，它是利用平滑型布鲁氏菌的脂多糖作抗原包被酶标板，用 灭活菌液免疫健康牛或人工感染健康牛制备阳性对照血清，标准弱阳 性血清，用健康非免疫牛血清作阴性对照血清，用单克隆抗体作竞争 抗体，酶标二抗羊抗鼠IgG，配制血清稀释液、洗涤液、底物溶液A、 底物溶液B、H₂O₂、终止液，组装组成；

所述的抗原包被酶标板制备方法如下：

(1)包被：无菌条件下，将冻干抗原用蒸馏水悬浮到冻干前 的体积，用0.05M pH9.6的碳酸缓冲液按1∶1000稀释，以100μl/孔， 包被聚苯乙烯96孔板，加盖于4℃过夜；

(2)洗涤：以0.01mol/L，pH值为7.2的PBST作洗涤液，加入 足量，室温作用3分钟后甩去，如上重复3次，或用洗板机重复洗3 次，拍干至无水印为止；

(3)封闭：用含1％牛血清白蛋白的0.01mol/L，pH值为6.3的PBST 按100ul/孔，加入至酶标板中，37℃作用1小时，甩去，加入足量洗 涤液，室温作用3分钟后甩去，如上重复3次，或用洗板机重复洗3次， 拍干至无水印为止，自然干燥；

(4)包装：将封闭好的酶标板放于铝箔袋中，加入1g包装的干 燥剂，用真空包装机将酶标板包装好，贴上标签；

所述的阳性对照血清制备方法如下：

(一)阳性对照血清的制备：

(1)制造用动物：制备阳性血清的牛需要经过实验室检测， 必须是18月龄性成熟、健康牛，无小肠结肠炎耶氏菌、乙型副伤寒杆 菌、大肠杆菌O:157感染，以及无繁殖系统感染等抗体阴性的健康牛； 观察一周；

(2)免疫原制备：将布氏杆菌S1119.3接种马铃薯浸液琼脂 扁瓶，置37℃培养48小时，待形成一层菌落时，选取纯净扁瓶，吸弃 凝集水，用含0.5％苯酚的灭菌生理盐水将菌苔洗下，倾入中性玻瓶中， 加甲醛溶液至终浓度为0.2％，置37℃振荡灭活48小时，经无菌检验合 格，于4℃以20000转/分钟离心10分钟，取沉淀，用生理盐水做10 倍稀释，用作免疫原；于2℃～8℃冰箱保存备用；

(3)免疫程序：用免疫原按5ml/点，分4点肌肉注射，免疫 动物，14日后，同法免疫一次，再14日后采血，分离血清，用ELISA 检测，血清OD_450nm和阴性血清OD_450nm的比值(P/N)＞1方可大量采 血；如检验不合格，应再加强免疫一次；

(4)血清制造：以常规方法采血，分离其血清，将其作为待 检血清，用血清稀释液作1∶2，1∶4......1∶128稀释，用质控强阳 性血清作参照进行ELISA试验，取待检血清OD_650nm/质控强阳性血清 OD_650nm值＝1时的待检血清稀释度作为血清稀释倍数，用血清稀释液 对血清进行稀释；

(5)分装：将血清用0.45μm的滤器进行抽滤除菌，无菌条 件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为0.02％以防腐，然后无菌 条件下定量分装、冻干，贴上标签；

(6)标准弱阳性血清制造：将强阳性血清用血清稀释液作 1∶1.5稀释；

所述的阴性对照血清制备方法如下：

(1)制造用动物：同阳性对照血清的制造用动物；

(2)血清制造：以常规方法采血，分离其血清；

(3)血清处理与分装：将血清用0.45μm的滤器进行抽滤除菌， 无菌条件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为0.02％以防腐，然 后无菌条件下定量分装，贴上标签；

所述的单克隆抗体是这样制备的：

(1)杂交瘤细胞株的培养：将杂交瘤细胞株从液氮中取出，置 于37℃水浴中迅速融化，1000转/分钟离心沉淀细胞，去掉冻存液， 加入10mlMEM培养基，分成两个培养瓶于37℃二氧化碳培养箱中培养， 2-3天细胞长满培养瓶底后，进行细胞计数；

(2)腹水单克隆抗体的制备：按0.5ml/只腹腔注射小鼠降植 烷，三天后，再按5X10^5-6/只的细胞浓度腹腔注射杂交瘤细胞，约十 天后产生腹水，每天采一次，连续采2-3次，腹水取出后，3000转/min 离心10min，收集上清并混合，于56℃水浴处理10分钟，-80℃冻存为 半成品；

(3)中间品检验：无菌检验  按“兽药典”进行，应无菌 生长；

(4)效价测定：取出质检过的动物布鲁氏菌病抗原包被酶标 板，每孔加入动物布鲁氏菌病抗体竞争ELISA诊断试剂盒的样品稀释 液45ul，动物布鲁氏菌病标准阴性血清5ul，加2排孔，标准阳性血清 5ul，加2排孔，动物布鲁氏菌病单克隆抗体以1∶10倍比稀释，每个稀 释度加2列，28℃孵育30分钟；单克隆抗体效价为OD₄₅₀为0.05至0.50 时的单抗稀释倍数；

(5)成品制备：按效价检测结果将单抗稀释，分装成0.2ml/ 瓶，密封瓶口，贴好标签，注明批次；

所述的血清稀释液、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B、H₂O₂、终 止液是10倍洗液、10倍样品稀释液、10倍底物A、底物B、H₂O₂、10倍 终止液；制备方法如下：

(1)10倍洗液的配制：氯化钠，8克；磷酸二氢钾，0.2克； 磷酸氢二钠12H₂O，6.29克；加蒸馏水至100毫升，加0.5毫升吐温20； 调pH值7.2，10磅高压15分钟；

(2)10倍样品稀释液的配制：氯化钠，8.5克；磷酸二氢钾， 0.2克；磷酸氢二钠12H₂O，6.29克；0.5毫升吐温20，EDTA，5.7克， 加蒸馏水至100毫升，pH6.3，10磅高压15分钟；

(3)10倍底物A溶液的配制：取柠檬酸4.2g，醋酸钠13.5g， 过氧化脲0.5g，加去离子水100ml，调pH值4.0，过滤除菌；分装： 1.2ml/瓶分装，密封瓶口，粘贴标签；

(4)底物B溶液的配制：取TMB 0.2192g，二甲基亚砜20ml， 室温下溶解；分装：0.2ml/瓶分装于黑瓶，密封瓶口，粘贴标签；

(5)10倍终止液的配制：取55.6毫升98％的浓硫酸加入80毫升 水中，调至总体积100毫升；分装：1.2毫升/瓶分装于小瓶，密封 瓶口，粘贴标签、批次。