[发明专利]一种肝素的提取、分离、纯化方法

权利要求书

1.一种肝素的提取、分离、纯化方法，其特征在于：按如下步 骤进行：蛋白酶水解法提取肝素、超声波辅助盐析法、树脂吸附分离 肝素及肝素的纯化；

蛋白酶水解法、超声波辅助盐析法提取肝素及树脂吸附分离肝素 包括下列步骤：

(1)酶解、盐解及过滤：将匀浆后的猪小肠粘膜移入提取锅，需 要加1∶15倍重量的水，用NaOH调pH至8.5，55℃加热半小时，加 入猪小肠粘膜质量2％的胰蛋白酶反应2小时，加入混合液质量5％的 NaCl在60℃反应2小时，之后将上述混合液加入到超声波药品处理 机内，超声温度为40℃，超声时间为40min，超声功率为300W，超 声处理之后用300目的滤布过滤；

(2)吸附：将上述滤液移入吸附罐中，在液体温度为40℃的条件 下，按原来猪小肠粘膜质量的8％加入D208树脂，搅拌吸附3小时；

(3)清洗：把(2)中的树脂倒入不锈钢桶中，用1.2mol/L的NaCl浸 泡洗涤30min；

(4)洗脱：把(3)中的树脂移入桶中用5mol/L的NaCl浸泡3小时，要 不时轻轻搅动，促使肝素解析；

(5)酸处理：将洗脱液用HCl调pH值至3.5处理30min；

(6)碱处理：将(5)得到的洗脱液用NaOH调pH至10处理3h；

(7)乙醇沉淀：将(6)中所得的洗脱液用1.5倍体积的95％酒精处理 12h，搅拌静置，虹吸出上层清液；

(8)干燥：把下层沉淀取出滤干，在60℃下真空干燥，得到肝素 粗品；

肝素的纯化包括下列步骤：

(1)Sephadex G50凝胶柱层析分离肝素：

①溶胶：用烧杯取2g Sephadex G50凝胶，用缓冲液在100℃水 浴中加热凝胶1～3h，然后采用倾泄法倾去上层小颗粒的浮胶，将溶 好的凝胶与过滤后的去离子水按3∶1W/V进行混合，柱子中应先装入 3～5mm缓冲液并关闭出水口；

②装柱：将①中溶好的凝胶与去离子水的混合液用玻璃棒搅拌均 匀后引流灌入3.6*85cm的柱子中，让凝胶自然沉积，打开出水口， 待凝胶自然沉积完毕后，关闭出水口；

③平衡：灌好的柱子胶面上用缓冲液加满直至进样口，并确保没 有气泡进入，然后进行平衡2～5柱床体积；

④上样：将肝素样品500mg用10mL缓冲液溶解后，用0.45um微 孔滤膜过滤，等缓冲液液面距离胶面2mm左右时将过滤后的肝素溶液 延柱壁缓慢加入，上样的流速2mL/min，上样体积为1.5mL；

⑤洗脱：样液进入胶床后与胶床基本平齐时用0.2mol/L NH₄HCO₃为流动相洗脱样品，流速为5mL/min，用咔唑法检测，收集不同的洗 脱峰，获得Mr不同的肝素分离组分；

⑥收集：将各次分离的相同洗脱峰样品合并，用旋转蒸发仪浓缩 后，冻干，选择经过Sephadex G50第一次分离、冻干样品用0.2mol/L 的NH₄HCO₃溶解，上样流速为2mL/min；用Superdex30凝胶层析柱进 行第二次分离，用0.2mol/L NH₄HCO₃为流动相洗脱样品，流速为 5mL/min，用咔唑法检测，再收集不同的分离组分，浓缩、冻干，得 到不同Mr的寡糖片段；

(2)QFF Spharose离子交换色谱分离肝素：

①装柱：将SP Sepharose FF凝胶填料用玻璃棒搅拌均匀后缓慢 倒入玻璃柱内，使凝胶自然沉积，待胶面平整后进行洗柱；

②洗柱：用蒸馏水清洗凝胶柱1h，直至pH为中性，流速为 2.0mL/min进行压柱；

③平衡：用0.2Mol/L的NaCl溶液即A液来平衡柱子，直到pH 为中性；

④进样：将经过QFF Sepharose凝胶柱层析分离系统分离后所获 得的Mr分布范围小即分子量3000-20000Da的组分20mg溶解于10m L蒸馏水中，用0.45um微孔滤膜过滤，上QFF Sepharose 90um 2.0 *25cm强阴离子交换柱，以1.0mL/min流度，进样量为1.5mL，其上 样方法与凝胶层析的方法一样；

⑤洗杂：用A液继续洗脱，流速为1.0mL/min，当用平衡缓冲液 洗脱至基线时，洗脱停止，这主要是洗脱掉不能吸附的色素及一些杂 蛋白，这时检测紫外波长在280nm的吸光值，每2mL为一管收集洗 脱液并检测有无肝素；

⑥洗脱：采用梯度洗脱法：将事先配好的2mol/L的NaCl溶液装 入恒流泵的B液瓶中，等A液瓶中的洗脱液即A液低于B液时并且已 经洗脱至基线时，将恒流泵中A、B液中间的阀门打开，使A、B混合， 并流入层析柱中进行洗脱；流速为5.0mL/min，在216nm波长处检测， QFF Spharose离子交换色谱分离肝素条件为：用水和2mol/L的NaCl 为流动相进行梯度洗脱，流速为5.0mL/min，在216nm波长处检测；

⑦收集：在紫外216nm处在线检测洗脱液，分别收集各阶段洗脱 峰，旋转蒸发仪浓缩，冻干，可获得不同肝素分离产物。

2.根据权利要求1所述的肝素的提取、分离、纯化方法，其特 征在于：缓冲液为去离子水。