[发明专利]一种肝素的提取、分离、纯化方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种肝素的提取、分离、纯化方法。

背景技术：

肝素(heparin)是天然的抗凝血物质，因而受到了世界各国的重 视。肝素广泛分布在哺乳动物的组织中，如肝、肺、肠粘膜、心、脾、 肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都有存在。肝素在体内多以与蛋白质 结合以糖蛋白复合物的形式存在。这种复合物没有抗凝血活性，但在 去除蛋白质后，这种抗凝活性逐渐表现出来。肝素用于临床虽有60 余年的历史，但到目前为止还没有一种能够完全代替它的产品，所以 它仍然是最重要抗凝血和抗血栓的生化药物之一。肝素具有强抗凝作 用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物，随着研 究的深入，人们发现肝素不但有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的作用， 还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。

肝素主要来源于畜禽副产物中的猪小肠黏膜、牛肺等，并且我国 是国际上最主要的肝素供应国，肝素钠是我国最重要的创汇产品之 一，80％的粗品或精品肝素出口到美国和德国。但我国应用的低分子 肝素主要依靠进口，是由国外将肝素钠再行降解形成低分子肝素后再 输入到我国。

目前临床上用于抗血栓的药剂主要是肝素制剂，据IMS统计， 2004年肝素市场的全球销售额已突破40亿美元。不断完善从粗品原 料到精品再到成品制剂完备的产业链，研究肝素制备技术的提升、创 新将具有重要的经济意义和社会效益。

猪小肠粘膜肝素是我国重要的出口的生化药物，但目前生产的肝 素产品存在着效价低、提取率低、环境污染大、不符合药典标准、产 品毒副作用大、活性低等缺陷，大多数是以粗品肝素的形式存在。

发明内容：

为解决背景技术中的不足，本发明提供一种肝素的提取、分离、 纯化方法，该方法所得到的肝素具有以下特点：(1)提取率可达 230.81mg/kg，比传统方法提高40％；(2)肝素的效价提高为150U/mg。

本发明所采用的技术方案内容是：该肝素的提取、分离、纯化方 法，按如下步骤进行：蛋白酶水解法提取肝素、超声波辅助盐析法、 树脂吸附分离肝素及肝素的纯化。

蛋白酶水解法、超声波辅助盐析法提取肝素及树脂吸附分离肝素 包括下列步骤：

(1)酶解、盐解及过滤：将匀浆后的猪小肠粘膜移入提取锅，需 要加1∶15倍重量的水，用NaOH调pH至8.5，55℃加热半小时，加 入猪小肠粘膜质量2％的胰蛋白酶反应2小时，加入混合液质量5％的 NaCL在60℃反应2小时，之后将上述混合液加入到超声波药品处理 机内，超声温度为40℃，超声时间为40min，超声功率为300W，超 声处理之后用300目的滤布过滤；

(2)吸附：将上述滤液移入吸附罐中，在液体温度为40℃的条件 下，按原来猪小肠粘膜质量的8％加入树脂，搅拌吸附3小时；

(3)清洗：把(2)中的树脂倒入不锈钢桶中，用1.2mol/L的NaCL浸 泡洗涤30min；

(4)洗脱：把(3)中的树脂移入桶中用5mol/L的NaCL浸泡3小时，要 不时轻轻搅动，促使肝素解析；

(5)酸处理：将洗脱液用HCL调pH值至3.5处理30min；

(6)碱处理：将(5)得到的洗脱液用NaOH调pH至10处理3h；

(7)乙醇沉淀：将(6)中所得的洗脱液用1.5倍体积的95％酒精处理 12h，搅拌静置，虹吸出上层清液；

(8)干燥：把下层沉淀取出滤干，在60℃下真空干燥，得到肝素 粗品。

肝素的纯化包括下列步骤：

(1)Sephadex G50凝胶柱层析分离肝素：

①溶胶：用烧杯取2g Sephadex G50凝胶，用缓冲液在100℃水 浴中加热凝胶1～3h，然后采用倾泄法倾去上层小颗粒的浮胶，防止 层析时堵塞凝胶网孔，将溶好的凝胶与过滤后的去离子水按3∶1 (W/V)进行混合，柱子中应先装入3～5mm缓冲液并关闭出水口；

②装柱：将①中溶好的凝胶与去离子水的混合液用玻璃棒搅拌均 匀后引流灌入3.6*85cm的柱子中，让凝胶自然沉积，打开出水口， 待凝胶自然沉积完毕后，关闭出水口，灌好后的柱子应该表面平整， 柱体没有气泡，以免影响分离，如表面不平就用玻璃棒将胶面轻轻搅 起，让其再自然沉降。如柱内有细小的气泡则应该重新装柱；