[发明专利]抗菌肽LFB-ME及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽及其制备方法。 

背景技术

抗菌肽是动物体内抵御外界微生物侵害、清除体内突变细胞的一类小分子多肽。抗菌肽具有广谱抗菌、抗肿瘤、调节免疫与消炎等多种生物学功能，同时具有无毒性、无耐药性、无残留与污染等优点，而且其热稳定性好，有希望成为新一代的抗菌剂，这些肽类抗菌物质显示了在医学、畜牧、兽医及其食品行业上潜在的研究和应用价值，近年来对抗菌肽的研究与开发成为研究热点。然而，与抗生素相比，抗菌肽的活性，尤其是抗菌活性不够理想，寻求功能理想、活性更强的抗菌肽是抗菌肽研究的热点问题。 

目前，在众多抗菌肽中，阳离子型的牛乳铁蛋白素(LfcinB)和天蚕素A(CecropinA，CA)是常见的两种抗菌肽，但是依然存在抗菌活性不高的问题。 

发明内容

本发明目的是为了解决现有抗菌肽的抗菌活性不高的问题，而提供抗菌肽LFB-ME及其制备方法。 

抗菌肽LFB-ME的氨基酸序列为：PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysTrpLysLeuPheLysLysIle。 

制备抗菌肽LFB-ME的方法按以下步骤进行：一、将牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列中第10位氨基酸Met替换为Trp，然后与天蚕素A的活性中心氨基酸序列进行杂合，再采用多肽合成仪进行固相化学法合成，得肽树脂；二、肽树脂经TFA切割后，得多肽，然后采用反相高效液相色谱进行纯化，即完成抗菌肽的制备；其中步骤一中牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列为PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgMetLysLysLeuGlyAla；步骤一中天蚕素A的活性中心氨基酸序列为LysTrpLysLeuPheLysLysIle；步骤一固相化学法合成中所用固相载体为Wang树脂(王树脂)，单体为Fmoc-氨基酸(9-芴甲氧羰基-氨基 酸)，缩合剂为DCC(N，N′-二环己基碳二亚胺)，活化剂为HOBt(N-羟基苯并三氮唑)，Fmoc脱除剂为体积浓度20％的六氢吡啶二氯甲烷溶液。 

本发明中制备抗菌肽的操作方法简单，所得抗菌肽LFB-ME对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌具有抑制作用，与牛乳铁蛋白素和天蚕素A相比，抗菌活性有了明显提高，且无溶血毒性和动物毒性，是一种健康安全、具有更好抗菌活性的抗菌肽。 

附图说明

图1为具体实施方式二中抗菌肽的质谱图。 

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式抗菌肽LFB-ME 的氨基酸序列为：PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysTrpLysLeuPheLysLysIle。 

具体实施方式二：本实施方式制备抗菌肽LFB-ME的方法按以下步骤进行：一、将牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列中第10位氨基酸Met替换为Trp，然后与天蚕素A的活性中心氨基酸序列进行杂合，再采用多肽合成仪进行固相化学法合成，得肽树脂；二、肽树脂经TFA切割后，得多肽，然后采用反相高效液相色谱进行纯化，即完成抗菌肽的制备；其中步骤一中牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列为PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgMetLysLysLeuGlyAla；步骤一中天蚕素A的活性中心氨基酸序列为LysTrpLysLeuPheLysLysIle；步骤一固相化学法合成中所用固相载体为Wang树脂，单体为Fmoc-氨基酸，缩合剂为DCC，活化剂为HOBt，Fmoc脱除剂为体积浓度20％的六氢吡啶二氯甲烷溶液。 

本实施方式中Wang树脂、Fmoc-氨基酸、DCC和HOBt按体积比1∶3∶4∶1混合。 

本实施方式具体操作步骤如下： 

抗菌肽LFB-ME的氨基酸序列为：N-PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysTrpLysLeuPheLysLysIle-C。 

1、制备从C端到N端逐个进行，由多肽合成仪自动控制。首先将Fmoc-Ile 接入Wang树脂，脱去Fmoc基团得Ile-Wang树脂；在Ile-Wang树脂上再链接Fmoc-Lys-Trt-OH(9-芴甲氧羰基-三苯基-赖氨酸)，再脱去Fmoc基团；依次从C端到N端逐个进行，至反应结束，得脱去Fmoc基团的侧链保护的肽树脂(具体操作步骤见多肽合成仪操作指南)。