[发明专利]一种制备重组几丁质酶的方法有效
| 申请号： | 200910075164.X | 申请日： | 2009-08-14 |
| 公开（公告）号： | CN101775405A | 公开（公告）日： | 2010-07-14 |
| 发明（设计）人： | 杨霞 | 申请（专利权）人： | 杨霞 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N9/42;C12R1/19 |
| 代理公司： | 山西太原科卫专利事务所 14100 | 代理人： | 朱源;王瑞玲 |
| 地址： | 030001山西省太原*** | 国省代码： | 山西;14 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 制备 重组 几丁质 方法 | ||
1.一种制备重组几丁质酶的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)根据几丁质酶基因CH的全长序列设计引物，在CH基因序列的5`末端 增加HIS标签序列HIS6，再将CH基因序列加HIS标签序列的基因克隆进入 pET-21b载体；接着再将分子伴侣PDI的全长基因序列克隆出来并连接到CH基 因的3`末端；然后在PDI基因序列的前端加入Prescission Protease蛋白酶切位点 序列pp，这样即重组成表达载体pET-21b-HIS6-CH-pp-PDI，相应表达出的重组 蛋白为HIS6-CH-pp-PDI；
(2)将步骤(1)中构建好的表达载体pET-21b-HIS6-CH-pp-PDI转化至大肠 杆菌Rosseta，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；同时将含有 Prescission Protease的质粒转入Rosseta菌株，同样用IPTG储液诱导表达，离心 收集菌体；然后将两种菌体混合在一起；
(3)用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整PH 值为7.0-8.0，低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出CH 蛋白，得到含有重组几丁质酶的溶液；
(4)将含有重组几丁质酶的溶液进行纯化处理，得到含有重组几丁质酶的精 品。
2.根据权利要求1所述的一种制备重组几丁质酶的方法，其特征是步骤(4) 中对含有重组几丁质酶的溶液进行纯化的具体步骤为，调整上述溶液的PH值为 7.0-8.0，然后上镍离子亲和柱，用Tris缓冲溶液上柱，50mM咪唑洗脱杂蛋白， 250mM咪唑洗脱目的蛋白；透析过夜，即得到重组几丁质酶的精品。
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