[发明专利]一种制备重组几丁质酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种制备重组几丁质酶的方法。

背景技术

几丁质(chitin)又称甲壳素，它是由N-乙酰-2-脱氧-D-葡萄糖以β-1，4糖 苷键连接而成的直链多糖，在自然界分布及其广泛。它的降解产物乙酸氨基葡 萄糖具有多种用途，而几丁质酶(chitinase，简称CH)则在这一降解过程发挥 着重要作用。几丁质又是所有害虫防御系统不可缺少的一部分，几乎所有昆虫 病原菌都有产几丁质酶的能力，这就肯定了几丁质酶在害虫生物防治中的重要 作用。一般昆虫类害虫的消化道的中肠具有围食膜结构，该结构由几丁质、蛋 白质、透明质酸构成，几丁质是其中主要成分，围食膜是蝗虫抵御病原菌的天然 屏障，几丁质酶水解蝗虫中肠围食膜中的几丁质，从而致使围食膜穿孔，破坏 其消化道，从而提高杀虫效率。另外，昆虫体表的外壳结构主要由蛋白质和几 丁质等生物高分子物质构成，其中几丁质含量可达80％，这是昆虫的又一道防 御屏障。几丁质酶可对蝗虫体表的结构几丁质产生一定程度的破坏作用，导致 其它致病菌或者其它农药侵人蝗虫体内，从而提高害虫感染率和致死率。

1971年，Smimoff首次成功地在苏云金杆菌制剂中添加微量几丁质酶用于 防治云杉卷叶蛾幼虫，与单用制剂相比，在低温下加速幼虫死亡，提高死亡率 的效果十分明显。17.1℃12h条件下，加酶处理96h和120h幼虫死亡率分别为 88％和100％；而单用制剂幼虫死亡率分别只有40％和65％。国内也有相关报道， 尹鸿翔等人将一株粘质沙雷氏菌与一种灭蝗剂的主要成分产碱假单饱菌混合 后，极大地提高了对蝗虫的致死率。公知，许多的微生物都可以产生几丁质酶， 例如沙雷氏菌属的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescen)，芽饱杆菌中的苏云金芽 抱杆菌(B.thruingiensis)、蜡状芽抱杆菌(B.eereus)及环状芽抱杆菌(Baeillus circulans)，豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)等等。跟其他种类产生的几丁质 酶一样，微生物所产生的几丁质酶也可分为外切几丁质酶(Exochitinase)和内 切几丁质酶(Endoehitinase)。不同来源的几丁质酶相对分子质量相差很大，变 化范围在1.9x10⁴～1.1x10⁵之间，等电点pH值一般在3.6～8.6，其水解可溶性 底物的速度较快，其次是水解胶体几丁质，水解粉状几丁质相当缓慢。因此， 能够快速大量的制备几丁质酶，对于我国工业、农业都具有重要的意义。但是 迄今为止，国内外仍未很好的解决几丁质酶的大规模生产问题，所有的研究都 还停留在试验阶段，而且得到的几丁质酶纯度较低，活性较低，不利于向大众 推广。例如，现在一些研究利用二步发酵的方法将微生物的营养生长发酵和产 酶发酵培养分开进行，使得哈茨木霉的产酶量比传统的灰褐链霉菌提高了四倍， 但是仍然不能满足工业化要求。随着基因重组技术的不断发展，利用基因克隆 和诱变筛选等途径大规模生产可溶高活性的几丁质酶，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明为了解决利用现有方法得到的几丁质酶产量低、纯度低、活性低等 问题，提供一种制备重组几丁质酶的方法。