[发明专利]人工合成猪生长激素基因及其表达纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA重组技术，具体涉及编码动物蛋白质的基因，更具体地说是一种人工 合成猪生长激素基因及其表达纯化方法。

背景技术

我国是一个以食用猪肉为主的养猪大国，存栏数达到约5亿头之多，猪肉产量占世界产量 的55％以上。生猪“瘦肉精”的残留在我国已经造成多起中毒事件，引起我国政府的关注。在 猪肉产量、品质和人类健康之间产生了生产者和消费者的矛盾。解决这一矛盾的有效途径是 找到一种更为安全的生长调节剂，同时提高肉产品的品质和产量，使生产者和消费者能同时接 受。

猪生长激素(porcine growth hormone，PGH)是由猪脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一 肽链的蛋白质激素(190-191aa)。给猪注射外源PGH，能显著提高猪的生长速率，降低单位饲 料的消耗量，促进肌肉的生长和减少组织的脂肪合成。最主要的是，PGH为蛋白质类激素制 品，不同于固醇类激素和人工合成的生长调节物质(如瘦肉精)，不在动物体内残留，使生肉 产品更为安全，是一种生产者和消费者都能接受的生长调节剂。

PGH最早是从猪的机体组织中提取的，但从脑垂体提取PGH成本太高既花费时间和精力， 而且产量很有限，无法应用于大规模的生产。随着科技的发展，人们开始通过微生物生产该 激素，Evock(Evock et al.，1991)等人首次用DNA重组技术在大肠杆菌(E.coli)中表达了重组 猪生长激素(rPGH)，其生物活性与由脑垂体提取的生长激素相同。目前为止，用大肠杆菌 表达系统得到的PGH多以包涵体形式存在，需包涵体的体外溶解并且蛋白质得到重新正确折 叠后才有活性；其次是PGH表达的表达量不够高，经过变复性后，最后得到的纯化的可溶性 PGH的产量偏低，不能用于工业大规模制备，因此，PGH的高成本限制了其在生产中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能在大肠杆菌中高效表达的人工合成猪生长激素基因及其表 达纯化方法，该方法适合于猪生长激素的大规模制备。

本发明根据已报道(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的猪生长激素的氨基酸序列和大肠杆菌 偏爱密码子的使用原则，设计编码与猪体内氨基酸序列一致的猪生长激素的核苷酸序列，进 行体外合成，在大肠杆菌中得到高效表达，并利用酸碱度进行包涵体变复性，得到纯化的可 溶性PGH。

本发明提供的一种人工合成猪生长激素基因，是序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列。 该人工合成猪生长激素基因长度为576bp的PGH基因序列，编码191个氨基酸。

人工合成猪生长激素基因在大肠杆菌中的表达纯化方法，包括如下步骤：

(1)构建含有人工合成的PGH基因的重组质粒pET-28a⁺-PGH；

(2)将重组质粒pET-28a⁺-PGH转化至宿主细胞BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的工程 菌株；

(3)将工程菌株接种到LB培养基溶液中培养，当工程菌培养液浓度OD₆₀₀达到0.6-0.8时， 加入0.5mmol/L IPTG，37℃诱导表达6小时，得到高效表达的PGH包涵体；离心，弃上清， 清洗包涵体；

(4)逐滴加入pH为12的含有2mol/L尿素的100mmol/L Tris缓冲液，溶解PGH包涵体；

(5)按0.1mL/min逐滴缓慢加入pH为8.5，含有50mmol/L Tris、sucrose 5％、2mol/L Urea 的复性缓冲液，4℃温育2小时，13000rpm，4℃离心30min，取上清，得到可溶性的PGH；

(6)用superdex-75凝胶层析的方法去除可溶性PGH中的尿素，得到目的蛋白PGH。目的 蛋白PGH纯度鉴定，在280nm与215nm处出现一个单峰。10％SDS-PAGE分析经变复性实 验及纯化的目的蛋白质，结果显示，本发明得到了电泳纯的目的蛋白质；Western blotting鉴 定结果进一步证实目的蛋白质及其纯度。

与现有技术相比本发明的优点和效果：

本发明使用了大肠杆菌偏爱密码子设计了PGH的基因序列，在大肠杆菌中得到了高效 表达，比之前的方法在表达量上有很大提高，占到菌体总蛋白表达量的70％左右。